2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K09552
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
長宗 秀明 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (40189163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田端 厚之 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 講師 (10432767)
友安 俊文 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 准教授 (20323404)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 口腔連鎖球菌 / 溶血毒素 / 病原性 / 分子進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コレステロール依存性細胞溶解毒素（CDC）やStreptolysin S型溶血毒素に加え，肺炎球菌に近縁なS. pseudopneumoniae（SPpn）で見出された，CDC相同ドメインとリパーゼ相同ドメイン（LD）を持つハイブリッド型毒素様タンパク質（LCDCLP）遺伝子についても口腔連鎖球菌において分布を解析した結果，特に興味深いLCDCLPでは検索した約50%のSPpn株でその遺伝子が見られ，さらにその半数弱で直前の短いORFとオペロン構造を作ることが分かった。またS. pneumoniae（SPn）やS. mitis（SM）等にも本遺伝子の保有株が見られたが，SPnの遺伝子はC末側に欠損があり，構造の多様性が認められた。そこでSPpn基準株のLCDCLP組換え体（rLCDCLP）を調製してヒト赤血球溶血活性や細胞障害活性を検討したところ，両活性は確認されなかったが，rLCDCLPはヒト細胞に顕著な結合性を示した。また抗rLCDCLP抗血清を調製し検討の結果，SPpn基準株はこの分子を分泌型及び菌体結合型として発現していた。さらに，SPpn基準株はSPnやSMの基準株に比べて強いヒト細胞接着性を示したが，抗rLCDCLP抗血清による菌体の前処理や，rLCDCLPによるヒト細胞の前処理で，SPpnのヒト細胞結合性は著しく低下した。従って，LCDCLPは溶血毒素ではなく細胞定着因子として機能し，SPpnの宿主細胞定着性はこの分子に依存することが示唆された。またLCDCLPの部分欠失変異体のヒト細胞結合性を調べた結果，CDCの膜結合ドメインやLDではなく，5ドメイン型CDCのN末端相同ドメインのタンデム構造がこの結合を担うことが判明した。現在，その受容体の探索やLCDCLP遺伝子の多様性と機能の相関，またLCDCLPとSPpnやSMの病原性との関連性の検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
口腔連鎖球菌におけるCDC型溶血毒素やStreptolysin S型のペプチド溶血毒素に加え，ハイブリッド型の溶血毒素様分子（LCDCLP）の遺伝子分布の解析やその組換え体の調製及び機能解析については順調に検討が進行しており，特にLCDCLPの機能解析の結果からは溶血性/細胞膜障害性ではなく宿主細胞定着機能を持つという予想外の興味深い知見が得られた。しかもLCDCLPが，本遺伝子を持つSPpn基準株の宿主細胞定着性を担っている可能性が見出されてきた。また，LCDCLP遺伝子には多様性があり，異なる構造を持つLCDCLPが異なる菌種に分布していることも分かってきた。このように，当初の研究計画を推進することで概ね順調に結果が出つつある。しかし，LCDCLPとSPpnの病原性の関係を解析するために必須となるLCDCLP欠損株の作製に際し，前提となる効率的なSPpn形質転換法が確立できていないため，今後その解決を図って研究を推進することが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
SPpnの効率良い形質転換法が確立されていないことから，現在はLCDCLP遺伝子K/O株やLCDCLP遺伝子発現調節機構の解析のためのゲノム改変株が取得できていない。今後は現在推進中の溶血毒素及びその派生分子の分子機能解析に加えて，SPpn等の効率的なコンピテント細胞の作製方法，例えば感受性促進ペプチドフェロモンを用いたケミカルコンピテント細胞やエレクトロコンピテント細胞の確立を進め，必要な遺伝子組換え株の取得と，それらを用いた解析を行う予定である。また，これまで高次構造が全く解明されていないLCDCLPの構造解明のために，LCDCLPの大量精製系の構築も進める予定である。
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| Causes of Carryover |
必要な試薬類が当初予定した額より安価で購入できたため，次年度への繰り越しとなった。この額は次年度の物品費に合わせて研究のために有効に使用する予定である。
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