Molecular biological analysis and investigation of diversity regarding the de novo virulence factors associated with oral streptococcal infections

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09560
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 高橋 幸裕 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (00281436)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 口腔レンサ球菌 / アドヘジン / 多様性 / バイオフィルム / 病原因子

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは、う蝕と歯周病、さらには感染性心内膜炎など歯性感染症の原因となる口腔バイオフィルム（デンタルプラーク）形成の初期に歯に付着する口腔レンサ球菌のHsaアドヘジンを同定した。このホモログ（類似蛋白）の多様性、およびこのアドヘジンと同様の機能をもつ新規のアドヘジンの存在の可能性がその後の研究および申請者らの予備実験により明らかになった。
この研究の目的は、Hsaを含むこれらアドヘジンの多様性を解明すること、および口腔レンサ球菌の新規アドヘジンを同定することである。これら多様性の解明と新規アドヘジン同定は、初期口腔バイオフィルム形成に関わる分子間結合様式の解明に寄与し、新たなプラークコントロール法の開発およびデンタルプラークをサンプルとした口腔バイオフィルム形成能および感染性心内膜炎病原性を評価する手段として臨床応用できる可能性を示すことを、この研究の最終的な目標とする。
2018年度は、研究実施計画のうち、レンサ球菌Hsaアドヘジンおよびそのホモログの検出と多様性の解析において、口腔サンプルからヒト口腔に常在するレンサ球菌の分離を行った。分離された口腔レンサ球菌について、菌種の同定を同定キットによる解析および 16S rDNA 塩基配列の解析により同定した。さらに、Hsaホモログの検出を、抗体を用いたドットブロット法により行い、ヒト赤血球に対する凝集活性を測定した。その結果、約50株の口腔レンサ球菌が分離、同定された。多様性については今後分離株をさらに増やし、系統解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2018年度は、研究実施計画のうち、「１）レンサ球菌Hsaアドヘジンおよびそのホモログの検出と多様性の解析」においては、上記のとおり順調に進展している。「２）赤血球凝集に関わる新規の口腔レンサ球菌アドヘジンの遺伝子の同定」については、１）において新規のアドヘジンを持つ菌株の分離について、新規であることの確証に時間を要している段階である。「３）赤血球凝集に関わる新規の口腔レンサ球菌アドヘジンの分子生物学的性質の解明」については、２）の同定がなされていないため、今のところ2020年度以降の課題とする予定である。

Strategy for Future Research Activity

2019年度は、研究実施計画のうち、「１）レンサ球菌Hsaアドヘジンおよびそのホモログの検出と多様性の解析」については、さらに分離菌株を増やす予定で、おもに、「２）赤血球凝集に関わる新規の口腔レンサ球菌アドヘジンの遺伝子の同定」について当初の予定どおり研究を推進していく予定である。すなわち、１）において新規のアドヘジンを持つ菌株について、同タンパク質の細胞壁への共有結合に関与するsrtA遺伝子の変異株を作製し、赤血球凝集活性が喪失するかどうかを確認する。同活性が喪失していて、菌種のゲノム情報が得られる場合は、細胞壁結合タンパクのＣ末端に共通して存在する細胞壁結合領域を持つ遺伝子を検索し、それぞれの遺伝子の挿入変異株を上記srtA変異株と同様の方法で作製する。赤血球凝集活性が喪失した変異株が目的の遺伝子に変異の入ったものであると考えられるため、同遺伝子を大腸菌の宿主・ベクター系にクローン化し、塩基配列を確認する。さらに、目的遺伝子の欠失変異株を作製し赤血球凝集活性の喪失を確認した後、同遺伝子のコンプリメンテーションで、欠失変異株の赤血球凝集活性が回復することを確認する。新規であることの確証に時間を要している段階である。「３）赤血球凝集に関わる新規の口腔レンサ球菌アドヘジンの分子生物学的性質の解明」については、２）の同定がなされていないため、2020年度の課題とする予定である。

Causes of Carryover

当初予定していた旅費、人件費がかからなかったため。これらは、翌年度分として請求した助成金と合わせて、旅費、人件費に充てるとともに、一部は、物品費、その他（主に解析受託サービス）として使用する予定である。