2019 Fiscal Year Research-status Report
Immunomodulatory MSC-mediated therapies for oral mucosal lesions
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18K09567
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
大野 純 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (10152208)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鍛治屋 浩 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (80177378)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 口腔粘膜疾患 / M1マクロファージ / M2マクロファージ / 免疫調節機能 / Th1型免疫応答 / 抗炎症作用 / iNOS / IL-6 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、免疫応答型口腔粘膜疾患へのM1マクロファージの動態について明らかにして、同細胞を軸とした病変の抑制法を検討している。令和元年度はin vitroにおけるマクロファージにおける免疫調節機能の抑制機序を主体に検討を行なった。マクロファージ様細胞としてRaw264.7（RAW細胞）を使用してin vitro実験に用いるマクロファージ・サブタイプ細胞の誘導を行なった。LPSおよびIFNg存在下での培養によりM1マクロファージを誘導し、またIL4存在下での培養によりM2マクロファージを作製した。これらのサブタイプの確認には、M1にはiNOSおよびM2にはMrc1をそれぞれマーカー遺伝子として使用し、RT-PCR法によりmRNA発現およびwestern blotting (WB)および免疫細胞染色（ICC）によりタンパク発現を、それぞれの細胞で確認した。また、誘導したM1あるいはM2マクロファージ細胞の培養上清を添加してRAW細胞を培養して、同細胞へのサブタイプへの分化誘導を確認した。さらに、誘導マクロファージ・サブタイプ細胞とRAW細胞の共培養により、RAW細胞がM1およびM2細胞に誘導されることを確認した。次に、Th1型口腔粘膜疾患モデル病変部からの単離したマクロファージ細胞（pM細胞）による影響を検討した。pM細胞からの培養上清はRAW細胞をM1マクロファージ誘導することがiNOS発現から明らかとなり、これらの細胞は炎症サイトカインであるIL-6産生能が亢進していた。また、IL-4によりM2マクロファージに誘導した細胞にpM細胞からの培養上清を添加すると、同細胞の遊走性が減弱し、抗炎症能の指標であるTNF-a産生も抑制されていた。これらの結果は、pM細胞にはM2マクロファージが保持している抗炎症作用である免疫調節機能を抑制させる働きがあることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
調書に記載した研究計画に従って実施した結果、概ね期待していた結果を得ることが出来ている。本年度は主として免疫応答型口腔粘膜病変に浸潤するマクロファージ群の病変発症および進行への関与について、とくに免疫調節機能の抑制機序に着目した。その結果、マクロファージ・サブタイプの中でM2マクロファージは口腔粘膜病変においても免疫調節型細胞として働く可能性が推測され、病変の進行はこれらのM2細胞の浸潤が抑制されM1型優位によるとの仮説がin vitro実験から裏ずけされた。さらに、この仮説は病変部から単離されたマクロファージ細胞（pM細胞）がIL-4により誘導されたM2マクロファージの抗炎症効果を著しく抑制することが明らかとなった。これらの結果は、当初期待していたpM細胞には免疫調節型マクロファージの機能を抑制する因子を含有することを示唆するものであった。しかしながら、DNAマイクロアレイによる検索ではpM細胞には、これらの抑制に関与する新規の遺伝子などは検索されておらず、この点に関しては期待通りではないものであった。すなわち、pM細胞からの産生されるサイトカイン群が抑制に関与する可能性が示唆され、次年度の検索課題となった。また、間葉系幹細胞(MSC）を用いて人為的な免疫調節型形質を保持した細胞の調整を開始した。現在までのところ、サイトカインなどによる刺激によってM2マクロファージと性状的に全く一致する人為的なMSCを誘導は出来ていない。すなわち、表面抗原などの検索ではMSCの性状を保持していたが、抗炎症作用は誘導され、さらにpM細胞によりこれらの抗炎症作用は減弱した。これらの結果から、免疫調節型MSC (M2-MSC)としての応用可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度に当たる令和２年度は「免疫調節型MSC（M2-MSC）によるTh1型口腔粘膜病変の進行抑制効果の判定」を中心とした研究活動を行う。
１）M2-MSC性状の解析：昨年度に誘導が可能となったM2-MSCの詳細な性状の解析を行う。とくに、同細胞がM2マクロファージに分化誘導されているのか、あるいはMSCとしての性状を保持して免疫調節機能を獲得したのかを、分子生物学的手法を主体として検討する。２）M2-MSCにおける免疫調節機能の解析：炎症サイトカインおよび抗炎症サイトカインの産生能を検証する。これらの機能が明らかとした後に、M1マクロファージに対して抗炎症作用が誘導できるかを検索する。具体的には、サイトカインにより誘導したM1マクロファージとM2-MSCを共培養することにより、M1細胞からの炎症サイトカインの減弱性を検索する。さらに、病変からのpM細胞に対しても同様の実験を行い、M2-MSCによる抗炎症作用の誘導を検討する。３）Th1型口腔粘膜疾患モデルにおけるM2-MSCによる病変抑制効果の検討：疾患モデルにM2-MSCを投与して、病変の発症および進行に対する抑制効果を判定する。１）～３）の検索により、M2-MSCによるTh1型粘膜病変の抑制効果を明らかにして、論文投稿を行う。
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| Causes of Carryover |
当該年度はブランディング事業からの助成金の一部で本研究課題内容の実験を遂行することが出来たため。また、次年度には当初予定していた額よりも、アッセイ関連の予算が必要であるため。
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