2018 Fiscal Year Research-status Report
間葉系幹細胞ー血管内皮細胞相互作用を応用した新規歯周組織再生治療開発
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18K09570
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
岩崎 剣吾 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (40401351)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 歯周病 / 再生医療 / 細胞移植 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病は現代日本人の最大の抜歯理由であり、その治療法は国民の生活の質の向上に寄与するものと考えられる。歯周病の進行によって歯を支える歯周組織は破壊され、最終的には抜歯へ至る。よって歯周組織を再生させる治療法に対するニーズは大きく、これまでにも数々の治療法が研究されている。近年、組織工学と幹細胞に関する研究の進歩から、培養した細胞を用いた治療法の可能性が幅広い疾患や再生医療において提唱されるようになった。歯周病においても細胞を用いた組織再生が研究され、組織再生が誘導される事が多く報告されている。歯周組織再生においては種々の組織から培養された間葉系幹細胞’(MSC)が用いられることが多いが、本研究では血管と組織再生の関係に着目してMSC移植による組織再生をさらに促進させる方法を見出すことを目的とした。
我々は血管形成の誘導によって歯周組織再生が増強する可能性について、まず培養細胞を用いて検証した。その結果、MSCと血管内皮細胞を共培養した際、MSC上へ血管内皮細胞が直接接着・進展し培養可能であることを観察し、その際のMSCおよび血管内皮細胞における遺伝子発現の変化について検討したところ、MSCでは血管内皮細胞との接着によって、骨芽細胞の初期の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの遺伝子発現が亢進していた。一方、血管内皮細胞においてはvon Willebrand factorの発現が亢進しており、血管内皮細胞としての機能の向上を示唆する結果が得られた。現在これらの直接的な二種類の細胞の接触による個々の細胞における変化について検証を行っている。
本研究は、MSC移植による歯周組織再生の向上のために血管内皮細胞を利用する事が可能であるか否かを検討する事を目的としており、平成30年度に得られた結果は血管内皮とMSCの接触を介した移植が骨、血管の再生に寄与する結果と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は間葉系幹細胞と血管内皮細胞の相互作用を利用しより多くの組織再生をもたらす細胞移植方法の開発、そしてそのメカニズムについて明らかにすることであった。使用する間葉系幹細胞として骨髄由来間葉系幹細胞を培養した。培養については以前からのプロトコールを用いて行い、細胞表面分子の発現をフローサイトメトリーで確認した。その結果、培養幹細胞はCD105, CD73, CD90陽性、CD45, CD34陰性であることが明らかとなった。また、in vitroにおいて骨芽細胞、脂肪細胞様細胞、軟骨細胞様に分化し, それぞれ石灰化結節、脂肪滴、軟骨基質の観察により3つの分化形質への分化能が確認された。一方、血管内皮細胞としてはマウス由来血管内皮細胞株ms-1を用いた。間葉系幹細胞と血管内皮細胞の直接的な相互作用を観察するため、PKH67,PKH26でラベルした細胞を用意し、単層培養したヒト間葉系幹細胞の上へマウス血管内皮細胞を播種したところ、マウス血管内皮細胞は間葉系幹細胞上へ接着した。この時の、各細胞種における遺伝子発現を検討するため、ヒト特異的あるいはマウス特異的なプライマーを設計し、その特異性をPCR法を用いて確認した。確認が取れたプライマーを用いて、骨芽細胞分化マーカーであるALP（ヒト）、血管内皮細胞の分化マーカーであるvWF(マウス)の発現を定量的PCR法を用いて検討したところ、血管内皮細胞との共培養によって骨髄間葉系幹細胞のALPが上昇し、一方、血管内皮細胞におけるvWF遺伝子の発現が上昇した。これらの結果は、骨髄間葉系幹細胞と血管内皮細胞の共培養によって、それぞれの細胞の分化が促進されたと考えられた。この二種類の細胞が直接接触する事でお互いの分化を亢進させることは、移植によって組織再生が増強される可能性を示唆するものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度の結果は、MSCと血管内皮細胞の接触を介した共培養が、細胞レベルでそれぞれの細胞の骨芽細胞への分化、および血管内皮細胞の成熟・分化への変化を誘導している事を示唆するものであった。この結果を受けて、さらに2種類の細胞でのこの直接的な変化について検証し、大きな変化が見られた場合には、そのメカニズムの検証を行う予定である。細胞接触による細胞機能の変化は、細胞接着分子の関与やパラクライン因子の影響が考えられる。接着による種々の細胞内シグナリングの活性化、そしてそれらを介した遺伝子発現、細胞分化方向の制御について検証が必要と考えられる。また、二種類の細胞を用いた際の実際の組織再生量の変化については、動物実験を用いた検討を行う。具体的な動物モデルとしては、歴史も長く広く論文的にも利用されている、マウス頭蓋骨骨欠損モデルを用いる予定である。本モデルをもちいて、MSC、血管内皮細胞について、単独の場合および両細胞を組み合わせた場合の再生組織形成量の変化を、マイクロCTあるいは組織切片作成後の組織形態計測によって比較検討を行う。また同時に、形成された組織について詳細に組織学的な観察を行い、結合組織、血管形成、再生組織の成熟度についても観察を行う。さらに、血管内皮細胞との組み合わせによって、移植されたMSCの生着に変化があったか否かについて、組織切片試料を用いた遺伝子発現検討によって明らかとする予定である。In vivoおよびin vitroの研究をもちいて、メカニズムと現象の検討を平行して行う。平成30年度の研究結果に基づいて、本年度は上記のような実験を予定している。
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| Causes of Carryover |
次年度への繰り越しが発生しているが、金額は非常に小さくほぼ端数に近いものと考えられる。よって予算についてはほぼ予定通りに使用した。翌年度についても、引き続き実験計画に則した使用状況となるよう努める。
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