Induction of differentiation of periodontal tissue constituent cells by regulating expression of miRNA

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K09583
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 高井 英樹 日本大学, 松戸歯学部, 准教授 (30453898)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小方 頼昌 日本大学, 松戸歯学部, 教授 (90204065)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: miRNA / 転写因子 / 分化誘導

Outline of Annual Research Achievements

10%ウシ胎児血清（FBS）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン を含むDMEMを用いて継代３～６までヒト歯根膜線維芽細胞（HPDL）を培養した。また、歯周組織構成細胞（特に歯肉線維芽細胞（HGF）およびHPDL）で骨芽細胞より優位に発現しているTwist２およびKlf12の３'-UTRに結合するmiRNAを公開データベースのTargetScanにて検索し、両遺伝子の３'-UTRに結合するmirRNAであるmir141および200aを用いて研究を進めた。mi141および200aが結合するKlf12の３'-UTR をPGL3 promoterルシフェラーゼプラスミドに挿入し、シークエンス解析を行い、正しい配列が挿入されたか確認した。さらに、mir141および200aが結合する配列に変異を挿入し、配列が変異されたか確認した。正しい配列が挿入されたルシフェラーゼプラスミドを挿入したHPDLはmi141または200aを細胞内に４時間導入後、 10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養し回収後にルシフェラーゼ活性を計測すると活性は抑制され、結合配列に変異が挿入されると活性に変化は認めたられなかった。次に、HPDLを様々な大きさのディッシュに播種し、mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養したHPDLを回収し、全RNAおよびタンパク質を抽出し、間葉系細胞に発現する転写因子RNAおよびタンパク質量をReal-time PCRおよびWestern Blotにて検索を行った結果、Twist2およびKlf12mRNAおよびタンパク質量を減少させ、Sox5およびSox6mRNAおよびタンパク質量を増加させた。また、HPDLをディッシュに播種し、mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで21日間細胞培養したHPDLをアリシアンブルー染色にて染色した。mir141または200aを導入した細胞はmirを導入していない細胞と比較して強く染色された。