2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞膜上のシアル酸修飾を起点とした修復象牙質形成機序の解明
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18K09587
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
室町 幸一郎 神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 助教 (50637072)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石井 信之 神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 教授 (20163610)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 歯髄・象牙質複合体 / 修復象牙質 / BMP-1 / 糖鎖 / シアル酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、歯髄・象牙質複合体の防御反応のひとつである修復象牙質形成におけるプロテアーゼを起点とした機序を解明することで、歯髄保存療法へ応用することを目的としている。
申請者はこれまでの研究から、①健全歯と比較して齲蝕罹患歯において象牙芽細胞様細胞および修復象牙質にbone morphogenetic protein (BMP) -1の発現が亢進すること、②BMP-1がヒト歯髄培養細胞の糖鎖プロファイリングの変化すなわちグライコームシフトをもたらすこと、③なかでも特にα2,6-linked sialic acid (α2,6-sia) 修飾が有意に減少することを見出している。
そこで本年度はα2,6-sia修飾されるタンパク質の同定と機能解析に向けた前段階として、α2,6-siaに特異的に結合するレクチンであるSambucus nigra agglutinin(SNA)を用いたlectin columnによる精製を試みた。競合糖による溶出後のサンプルをSNAを用いたlectin blottingにて解析し精製の確認を行った。精製後のサンプルを脱塩・濃縮し、SDS-PAGEにて展開後にCoomassie Brilliant Blue（CBB）染色を行い、切り出したゲルを質量分析へ供し解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はα2,6-sia修飾されるタンパク質の同定の前段階として、ヒト歯髄培養細胞の膜画分から目的とする糖タンパク質を精製する条件検討を行う計画であった。具体的には、①膜画分の可溶化条件（最適な界面活性剤の選択と至適濃度）の検討、②α2,6-Sia特異的に結合するlectinを応用したカラムおよび競合糖であるsialyl-lactoseによる溶出方法を用いた膜画分の精製法についての検討を行った。
①については、Triton X-100やNP-40などの界面活性剤の種類や濃度を試行し、SDS-PAGEにてバンドが濃染される条件を選択した。
②については、α2,6-Sia特異的に結合するlectinであるSNAを用いたcolumnにより精製および濃縮を行い、CBB染色にてバンドが確認できたことから質量分析に必要なタンパク質量は確保したものと判断した。現在、切り出したバンドをLC-MS/MS解析に供しタンパク質の同定を試みている。
従って、本研究はおおむね順調に進展しているものと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究結果をもとに、α2,6-sia修飾されるタンパク質の同定を現在実施中である。今後は、同定されたタンパク質の確認と機能解析を行う。
シアル酸修飾の有無によりタンパク質の細胞内局在や活性が変化することが知られている。BMP-1は象牙質形成において重要な働きを担っており、BMP-1ノックアウトマウスでは象牙質形成不全に加えて象牙芽細胞層の配列が乱れることが報告されている。
BMP-1によるα2,6-sia修飾の減少がコアとなるタンパク質の局在を変化させることが予想されることから、共焦点レーザー顕微鏡を用いた蛍光免疫染色を行う。
さらにshRNAを用いたRNA干渉を行い、同定されたタンパク質の硬組織形成における役割についても検討を行う。
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| Causes of Carryover |
本年度は、α2,6-sia修飾されるタンパク質の機能解析までには至っていないため論文投稿は行っていない。そのため、当初予定していた投稿料が発生しなかったため次年度使用額が生じた。英語論文校正などの論文投稿に必要な経費として2019年度請求額とあわせて使用する予定である。
本研究計画を遂行するにあたり、同定されたα2,6-sia修飾されるタンパク質の細胞内局在を解析するために蛍光免疫染色を予定しており、Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 fragments goat anti-rabbit IgGやAlexa Fluor 488 phalloidinを購入する予定である。また得られた結果を国内外で公表するために、日本歯科保存学会、日本歯内療法学会、日本CCNファミリー研究会、IADR、The World Endodontic Congressへの参加費としての使用を予定している。
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