2019 Fiscal Year Research-status Report
ユビキトーム解析による歯周疾患のバイオマーカー開発
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18K09593
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
土田 祥央 千葉大学, 医学部附属病院, 特任助教 (90410422)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 守 千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20401002)
西村 基 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (80400969)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | GCF / HGFs / プロテオミクス / 質量分析計 / ユビキチン化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の技術革新により、タンパク質のユビキチン化を網羅的に探索することも可能になりつつあるが、歯周疾患の解明に応用するための方法論は確立されていない。本研究はユビキトーム解析を発展させ、様々な疾患に起こりうる代表的な翻訳後修飾であるユビキチン化に焦点をあてて、歯周疾患におけるユビキチン化を網羅的探索により捉え、歯周疾患の早期診断および再発予測治療効果判定等に応用することを目的としている。
キャリアプロテインの影響を受けずに高効率で再現性が良い有機溶媒沈殿法を用いて歯肉溝浸出液(GCF) とヒト歯肉線維芽細胞(HGFs)からペプチドの抽出を試みた。抗ユビキチン抗体をカップリングしたカラムにGCFタンパク抽出液ならびにHGFs細胞抽出液を添加し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降を行って、ユビキチン化タンパク質を濃縮した。精製したユビキチン化タンパク質をトリプシン消化後、質量分析装置を用いたショットガン解析を行った。ユビキチン化されたリシン残基を含むトリプシン消化ペプチドピークを検出した。ポリユビキチン化タンパク質のトリプシン消化で生じるユビキチン由来のLys-Gly-Glyを含むシグネチャーペプチドの配列はポリユビキチン鎖の結合型ごとに特有であることが予想される。従って、現在、各結合型に特有なシグネチャーペプチドの検出とMS/MS解析による結合型の特定とショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の種類の同定を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖種類の同定とSILAC（stableisotope labeling by amino acids in cell culture）法によってユビキチンリガーゼの基質探索を試みた。細胞培養液中の必須アミノ酸を安定同位体標識したものに置き換えたサンプルを調整し、混合して質量分析計で測定する手法である。この手法は非標識と標識を質量分析計で区別できるため、ペプチドの同定と同時に複数サンプルの比較定量が可能であった。しかし、本研究課題の進捗状況はやや遅れいると思われる。その理由はユビキチンリガーゼアダプタータンパク質の調節器として作用するF-Box タンパク質を 中心に網羅的な基質探索に労力がかかってしまったためである。質量分析技術によるユビキチン鎖のトポロジー解析ならびにショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の同定についても若干遅れたが、想定内の遅れであった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後もユビキチンリガーゼの網羅的基質探索.SILAC法によってユビキチンリガーゼの基質探索を試みる。歯周疾患マーカー候補ユビキチン化タンパク質・ペプチドのバリディーション歯周疾患のバイオマーカーユビキチン化タンパク質・ペプチド候補の妥当性を検討するため特定のタンパク質におけるユビキチン化を確認する場合には、特異性抗体で標的タンパク質を免疫沈降した後に、抗ユビキチン抗体を用いたウエスタンブロットを行う。歯周疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイを作成する。歯周疾患マーカーの質量分析計を用いた定量系の確立を目指す。特異抗体の作成が困難な場合は、三連四重極型質量分析計を用いたMRM法を利用する
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| Causes of Carryover |
購入予定であった試薬と処理キットが国内に在庫が無く、海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、繰り越している。 次年度以降は当初の研究計画にそって使用していく。
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