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2020 Fiscal Year Research-status Report

ユビキトーム解析による歯周疾患のバイオマーカー開発

Research Project

Project/Area Number 18K09593
Research InstitutionNihon University

Principal Investigator

土田 祥央  日本大学, 医学部, 助手 (90410422)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 佐藤 守  千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20401002)
西村 基  千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (80400969)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2022-03-31
KeywordsGCF / HGFs / 質量分析計 / ユビキチン化 / プロテオミクス
Outline of Annual Research Achievements

近年の技術革新により、タンパク質のユビキチン化を網羅的に探索することも可能になりつつあるが、歯周疾患の解明に応用するための方法論は確立されていない。本研究はユビキトーム解析を発展させ、様々な疾患に起こりうる代表的な翻訳後修飾であるユビキチン化に焦点をあてて、歯周疾患におけるユビキチン化を網羅的探索により捉え、歯周疾患の早期診断および再発予測治療効果判定等に応用することを目的としている。
キャリアプロテインの影響を受けずに高効率で再現性が良い有機溶媒沈殿法を用いて歯肉溝浸出液(GCF)とヒト歯肉線維芽細胞(HGFs)からペプチドの抽出を試み,抗ユビキチン抗体をカップリングしたカラムにGCFタンパク抽出液ならびにHGFs細胞抽出液を添加し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降を行って、ユビキチン化タンパク質を濃縮した。精製したユビキチン化タンパク質をトリプシン消化後、質量分析装置を用いたショットガン解析を行った。現在、各結合型に特有なシグネチャーペプチドの検出とMS/MS解析による結合型の特定とショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の種類の同定を行っている。更に、HGFsの健常群と疾患群を混合して結合タンパク質を用いた免疫沈降し、SILAC法(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)にて同定と同時に定量を試みている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

SILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)細胞培養液中のアミノ酸を用いた安定同位体ラベルは、複雑なタンパク質サンプル中のタンパク質の同定と、発現量の比較定量を可能とする手法である。本年度はSILAC法に多大な労力と時間を費やしてしまい、大幅に遅れてしまった。各結合型に特有なシグネチャーペプチドの検出とMS/MS解析による結合型の特定とショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の種類の同定についても若干遅れたが、想定内の遅れであった。

Strategy for Future Research Activity

歯周疾患のバイオマーカーユビキチン化タンパク質・ペプチド候補の妥当性を検討するため、歯周疾患マーカー候補ユビキチン化タンパク質・ペプチドのバリディーションをウエスタンブロットにて行う予定である。
HGFsの健常群と疾患群を混合して結合タンパク質を用いた免疫沈降し、引き続きSILAC(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)法にて同定と同時に定量を試みる。また、歯周疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイを作成する予定である。最終的に歯周疾患マーカーの質量分析計を用いた定量系の確立を目指す。特異抗体の作成が困難な場合は、三連四重極型質量分析計を用いたMRM法を利用する。MRM法の選択性とダイナミックレンジは格段に高く、その結果、複雑な試料から目的のペプチドを検出することも可能となる。また内部標準を用いれば標的ペプチドの絶対定量が可能な点も特徴である。ペプチドをダイレクトに測定可能であり、分子選択性が高く、高感度(ng/ml以下の検出感度)・同時多項目定量分析が可能である。

Causes of Carryover

現所属先の日本大学医学部病態病理学系臨床検査医学分野の臨床検査専門医にも随時指導を受け、細かい軌道修正をしながら研究を実行する。歯周病学,質量分析,臨床検査医学の専門家の協力を得て、多面的に研究を遂行する体制を整えることができたと考えている。
設備、技術、学術、いずれの面においても十分な研究環境にあるが、臨床応用に耐えうる正確で安定した測定系を構築するためには数多くの試行錯誤と工夫を繰り返す必要がある。検査系を立ち上げ、安定させ、有用性を検証し、実臨床に応用するまでには消耗品を多く要することになる。しかし、購入予定であった試薬と処理キットが国内に在庫が無く、コロナ禍により海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、繰り越している。 次年度は当初の研究計画にそって使用していく。

  • Research Products

    (7 results)

All 2020

All Journal Article (6 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 2 results) Presentation (1 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Proteomic analysis of human immunodeficiency virus and periodontitis2020

    • Author(s)
      Tsuchida Sachio、Nakayama Tomohiro
    • Journal Title

      Expert Review of Proteomics

      Volume: 17 Pages: 793~795

    • DOI

      10.1080/14789450.2020.1879648

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Current Status of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization?Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in Clinical Diagnostic Microbiology2020

    • Author(s)
      Tsuchida Sachio、Umemura Hiroshi、Nakayama Tomohiro
    • Journal Title

      Molecules

      Volume: 25 Pages: 4775~4775

    • DOI

      10.3390/molecules25204775

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Proteome Analysis of Molecular Events in Oral Pathogenesis and Virus: A Review with a Particular Focus on Periodontitis2020

    • Author(s)
      Tsuchida Sachio
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 21 Pages: 5184~5184

    • DOI

      10.3390/ijms21155184

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Mass spectrometry-based microbiological testing for blood stream infection2020

    • Author(s)
      Nomura Fumio、Tsuchida Sachio、Murata Syota、Satoh Mamoru、Matsushita Kazuyuki
    • Journal Title

      Clinical Proteomics

      Volume: 17 Pages: 14

    • DOI

      10.1186/s12014-020-09278-7

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] An in-house centrifugation and membrane filtration technique for identifying microorganisms from positive blood culture bottles with high identification rates using matrix-assisted laser desorption ionization?Time-of-flight mass spectrometry: A preliminary report2020

    • Author(s)
      Tsuchida Sachio、Murata Syota、Miyabe Akiko、Satoh Mamoru、Takiwaki Masaki、Matsushita Kazuyuki、Nomura Fumio
    • Journal Title

      Journal of Infection and Chemotherapy

      Volume: 26 Pages: 266~271

    • DOI

      10.1016/j.jiac.2019.09.017

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 【究める!臨床検査 遺伝子解析技術の革新がもたらす臨床検査とは】病原体核酸検査 臨床微生物検査における質量分析技術 質量分析技術による細菌同定を中心に2020

    • Author(s)
      土田 祥央, 村田 正太, 野村 文夫
    • Journal Title

      臨床病理レビュー

      Volume: 164 Pages: 76-83

  • [Presentation] 病院検査部で活躍する質量分析技術-現状と展望- 質量分析技術による血液培養陽性ボトルからの微生物直接同定の現状と課題2020

    • Author(s)
      土田祥央, 村田 正太, 野村 文夫, 中山 智祥
    • Organizer
      日本医療検査科学会
    • Invited

URL: 

Published: 2021-12-27  

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