2021 Fiscal Year Research-status Report
ユビキトーム解析による歯周疾患のバイオマーカー開発
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18K09593
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
土田 祥央 日本大学, 医学部, 助手 (90410422)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 守 千葉大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20401002) [Withdrawn]
西村 基 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (80400969)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 歯周疾患 / ユビキトーム解析 / 質量分析計 / ユビキチン化 / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年の技術革新により、タンパク質のユビキチン化を網羅的に探索することも可能になりつつあるが、歯周疾患の解明に応用するための方法論は確立されていない。本研究はユビキトーム解析を発展させ、様々な疾患に起こりうる代表的な翻訳後修飾であるユビキチン化に焦点をあてて、歯周疾患におけるユビキチン化を網羅的探索により捉え、歯周疾患の早期診断および再発予測治療効果判定等に応用することを目的としている。
本研究は歯肉溝浸出液(GCF)ならびにヒト歯肉線維芽細胞（HGFs）中のユビキチン化タンパク質・ペプチドを探索し、同定後、ポリユビキチン鎖の種類も同定する。見出されたマーカー候補について、質量分析計により直接定量可能なアッセイ系を確立する。また、歯周疾患で高発現しているユビキチン化タンパク質についてもユビキチン化部位を含むペプチドを合成してペプチドアレイを作製する計画である。
高効率で再現性が良い有機溶媒沈殿法を用いてGCFとHGFsからペプチドの抽出を試み,抗ユビキチン抗体をカップリングしたカラムにGCFタンパク抽出液ならびにHGFs細胞抽出液を添加し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降を行って、ユビキチン化タンパク質を濃縮した。精製したユビキチン化タンパク質をトリプシン消化後、質量分析装置を用いたショットガン解析を行った。各結合型に特有なシグネチャーペプチドの検出とMS/MS解析による結合型の特定とショットガン解析で特定の標的タンパク質に結合したポリユビキチン鎖の種類の同定を行った。HGFsを用いて結合タンパク質を用いた免疫沈降し、SILAC法(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)にて同定と同時に定量を試みた。更に疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイを作製中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
HGFsの健常群と疾患群を混合して結合タンパク質を用いた免疫沈降し、SILAC法(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture)にて同定と同時に定量を試みているが、購入予定であった試薬と処理キットがコロナ禍により国内に在庫が無く、海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、進捗状況はやや遅れている。歯周疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイを作製中である。次年度も当初の研究計画にそって進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
現所属先の日本大学医学部病態病理学系臨床検査医学分野の臨床検査専門医にも随時指導を受け、細かい軌道修正をしながら研究を実行する。歯周病学、質量分析、臨床検査医学の専門家の協力を得て、多面的に研究を遂行する体制を整えることができたと考えている。 設備、技術、学術、いずれの面においても十分な研究環境にあるが、臨床応用に耐えうる正確で安定した測定系を構築するためには検証を繰り返す必要がある。本年度では疾患で上昇傾向が示唆されたユビキチン化ペプチドを合成してアレイを作製し、安定させ、有用性を検証し、実臨床に応用する。
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| Causes of Carryover |
本計画を遂行するためには多くの消耗品が必要であった。しかし、購入予定であった試薬と処理キットがコロナ禍により国内に在庫が無く、海外取り寄せで年度内での納品ができなかったため、繰り越している。次年度はアレイ作製のために使用する。
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