2018 Fiscal Year Research-status Report
血管内皮細胞を介した歯髄組織再生制御因子の網羅的解析と再生制御システムの創出
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18K09594
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
金子 友厚 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (70345297)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 歯髄再生 / 幹細胞 / 血管内皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、間葉系幹細胞をスキャホールドとともに冠部歯髄を除去したラット臼歯歯髄腔に移植し、mineral trioxide aggregate(MTA)セメントで仮封すると、デンティンブリッジを有する歯髄組織が、約２週間で再生可能であることを報告し、歯髄組織再生の経時的な動物実験系を確立している。この実験系を用いて、間葉系幹細胞と血管内皮細胞を混合移植すると、血管新生能が亢進し組織の再生が促進されることも報告している。そこで本研究課題では、これまでの成果をさらに発展させ臨床応用への革新的技法を創成することを究極の目的として、血管内皮細胞を間葉系幹細胞と混合して移植した際に、再生組織中で特徴的に発現する「再生制御因子」を遺伝子網羅解析にて見出すとともに、同因子が血管内皮細胞、幹細胞、あるいはマクロファージの増殖、分化、活性化等に及ぼす影響を明らかにし、血管内皮細胞を介した歯髄組織再生の制御システムを見出すことを本研究の目的とする。前年度は、上記のモデルを用いた再生歯髄組織の評価と再生促進因子の解析を目的として、以下の実験を実施した。血管内皮細胞と幹細胞の共培養による歯髄組織再生制御因子の網羅的解析、ラット歯冠歯髄再生モデルを用いた血管内皮細胞の動態解析、および歯冠歯髄を除去した上顎臼歯への幹細胞添加三次元スキャホールドの埋入実験を行い以下の結果を得た。幹細胞、血管内皮細胞混合移植で組織再生が促進することを確認するとともに、GFPを遺伝子導入した血管内皮細胞が移植14日後においても新生歯髄組織内で血管を形成することを見出した。さらに歯髄幹細胞・血管内皮細胞混合移植の再生促進効果に関係のある遺伝子として、血管新生関連遺伝子（B-cell lymphoma 2、nuclear factor-kappa Bなど)が同定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年の研究計画と、おおむね同様に研究は遂行された。
ラット上顎第一臼歯歯冠歯髄歯髄腔に再生した歯髄組織を検索対象として、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、そして免疫組織化学的染色法を用い細胞や神経に発現する特異的タンパク発現、そしてウェスタンブロット法を用い、歯髄組織におけるタンパク発現の解析を行っている。
主な研究成果としては、骨髄幹細胞、血管内皮細胞混合移植による組織再生促進を確認するとともに、これに関連する遺伝子をマイクロアレイにて解析し、血管新生への関連が知られるB-cell lymphoma 2やnuclear factor-kappa Bを同定することができた。
さらに、GFP遺伝子を導入した血管内皮細胞を移植したところ、これらが再生歯髄組織内に集積し、血管様の構造を示すことを確認し、移植された血管内皮細胞が再生組織中で生存するのみならず、血管へと再生を示す可能性が示唆された。これらの研究結果は、Stem Cell Researchなどの海外雑誌に受理された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、前年度までの解析を継続するとともに、以下の実験を実施する。
a.再生歯髄組織における血管内皮細胞とマクロファージの動態の検索：再生した歯髄組織を、免疫組織学的に観察する。CD31(血管内皮細胞マーカー)、あるいはCD146(血管内皮細胞マーカー、幹細胞マーカー)を第一抗体とし、ついでCD68(マクロファージマーカー)、CCR7（M１マクロファージマーカー）、CD163（M2マクロファージマーカー）、あるいはCD206（M2マクロファージマーカー）を第二抗体として、血管内皮細胞とマクロファージとの免疫二重染色を行い、特徴的な動態を示すマクロファージ群を見出す。
b.再生歯髄組織における血管内皮細胞と幹細胞の動態の検索：再生した歯髄組織を、免疫組織学的に観察する。CD31(血管内皮細胞マーカー)、あるいはCD146(血管内皮細胞マーカー、幹細胞マーカー)を第一抗体とし、ついでラット歯髄幹細胞のマーカーと考えられる8)STRO-1、あるいはMAP1Bを第二抗体として免疫二重染色を行い、血管内皮細胞と幹細胞の動態を検索し、特徴的な動態を示す幹細胞群を見出す。
c. 血管内皮細胞による歯髄組織再生制御因子の絞り込み
実験a,bから特徴的な動態を示した細胞群を認識した一次抗体を選択して免疫染色後、免疫レーザーマイクロダイゼクションにより、血管内皮細胞と幹細胞（あるいは血管内皮細胞とマクロファージ）および陽性細胞周囲の組織をそれぞれ別々に採取し、Total RNAの抽出後、上述(実験1)のマイクロアレイシステム(ThermoFisher社)を用い各実験群において発現が特徴的に変量する遺伝子をデータ解析ソフトウェア(TAC Ver4.0,ThermoFisher社)を用いて絞り込む。
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| Causes of Carryover |
残額分の詳細が、執行期限までに不明だったために、1372円繰り越すこととなった。1372円の繰越金は、今年度での消耗品購入費（プラスチックチューブ類）に使用する。
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