血小板マイクロパーティクル中の転写因子による抗炎症作用と歯周再生

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09595
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 川瀬 知之 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90191999)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 血小板 / 多血小板血漿 / microparticle / 抗炎症 / PPARγ / 増殖因子 / α顆粒

Outline of Annual Research Achievements

1)microparticle (MP)の放出現象の確立と可視化: 血小板の活性化に伴うMPの放出現象の確立と可視化を第一の目標として取り組んだ．従来は，活性化血小板からのα顆粒等の放出は透過型電子顕微鏡(TEM)において観察されてきた．しかし，諸般の事情から，走査型電子顕微鏡(SEM)での観察を可能にする条件の最適化を試みた．血漿タンパクを適度に除去できるSEM試料調製用特殊フィルターを用いて，0.01% CaCl2で血小板を10分間程度刺激してところで水分を吸引し血小板をglutaraldehydeで固定すると，再現性よくMPをSEMで観察できることを見出した．
2)洗浄血小板中からの増殖因子放出の可視化: 血小板のマーカーともいえる増殖因子(TGFβ1, PDGF)はα顆粒中に貯蔵されていて，活性化に応じて血小板の外に放出される．MPとPPARγの局在が一致しているかどうか明らかにすることを目的として検討を重ねたが，結論を得るまでには至っていない．免疫蛍光染色(IF)による継時的な観察の結果から，これらの増殖因子は活性化によって血小板から放出されMP中にとどまってない可能性が高いことが示唆された．α顆粒中に保存されているPPARγもMP中にとどまっていない可能性が高い．
3)PRF中の血小板と増殖因子放出の可視化: われわれは並行して，PRF中の血小板の局在をパラフィン切片に対して抗CD41抗体を用いて可視化するプロトコールを確立した．低速遠心にて調製するA-PRFの場合，血小板は広範囲にびまん性に局在していたのに対して，比較的高速遠心にて調製するCGFの場合，血小板は遠心力がかかる採血管との接触面に集中して局在するという所見を得た．ただし，ここでもMPを可視化する試みはまだ成功していない．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

活性化された血小板MP放出現象は確認できたものの，MP中にPPARγが含まれていることを証明するには至らなかった． これは，prostaglandin E1にて血小板の活性化を有意に抑制しても同様の所見であったことから，遠心によるPRP調製時に血小板の活性化とそれに引き続いてα顆粒中の増殖因子やPPARγの放出が相当のベルで惹起されるためかもしれない．
また，白血球とPPARγの局在が一致するような所見も得られていない．これは，血液の保存期間と白血球の生存時間や活性維持との関係が影響している可能性が考えられる．室温で保存中の血液の中では，好中球や単球などの比較的大型の白血球が数時間単位で消滅していく．そのため，リンパ球は白血球分画の大多数をしめるようになる．エネルギー源としてグルコースを添加してある抗凝固剤(ACD-A)中ではリンパ球の機能維持は可能と思われるが，PPARγを取り込む主体がリンパ球ではない可能性を考慮する必要がある．あるいは，好中球が主体となっている場合，常時新鮮な血液を必要量入手して使用することが困難なことが実験結果に影響している可能性も考えられる．

MPの評価法としてフローサイトメーターによる解析もある．サイズとCD41陽性でゲーティングして定量解析したが，固定のタイミングや洗浄に伴う遠心条件の最適化が順調に運ばず，ポジティブな実験系においても，いまひとつ再現性のある結果を得ていない．

Strategy for Future Research Activity

研究推進の前提として，MPの局在とPPARγあるいは増殖因子との局在が一致した所見が必要であると考えている．そのためには，MPの局在をIFにて可視化する方法を確立する必要がある．活性化血小板のマーカーでもあるCD62PやCD63が有力な候補であるが，そのほかにサイズ情報を加味することによって，MPを可視化する．
血小板の活性化を可及的最大に抑制するためには，Prostaglandin E1のほか，抗血小板剤であるアスピリンの応用が有効と思われる．われわれが最近開発した簡便な血小板凝集活性測定法により，アスピリンは最大50%の凝集活性を抑制することが確認されている．さらに，中和抗体などでfibrin/fibrinogenとの結合を抑制することにより，血小板中に温存されているMPとPPARγの可視化を可能としたい．
可視化の方法については，予備実験の結果からフローサイトメーター(FCM)による分析を凍結しIFに集中していたが，FCM分析に関する有益な文献を入手したことから，実験条件を見直して，再度MP定量解析への道を切り開きたいと考えている．
白血球については，抗凝固剤をACD-Aからグルコースを含まないクエン酸に替えることで，リンパ球の関与を評価する．また，できる限り多くのドナーを募って，新鮮血を使用することにより，好中球の関与を検討する．一方，PRP中にふくまれる白血球数は血小板の1/100程度なので，白血球を増やすために，PRPとは別途リンパ球分画を調製して，あるいはHL-60などの細胞株を利用して，PRPと混合することにより，リンパ球の関与を追及できるのではないかと考えている．