2022 Fiscal Year Research-status Report

歯肉上皮組織自然免疫システムの調節により歯周病原細菌の結合組織侵入を阻止できるか

Research Project

Project/Area Number	18K09615
Research Institution	Fukuoka Dental College
Principal Investigator	金子高士福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (10284697)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	吉永泰周福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (60452869)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2024-03-31
Keywords	インフラマソーム / カスパーゼ４ / カスパーゼ５ / ピロトーシス / 歯周病原細菌 / カスパーゼ１ / NLRP3
Outline of Annual Research Achievements	歯周炎歯周組織において一部の歯周病原細菌が歯肉上皮組織や、さらに深部の結合組織内に侵入していることが報告されている。しかしながら角化層、顆粒層、有棘層、基底層、基底膜から構成される重層上皮において、どのような経路で細菌が侵入しているか明らかではない。非定型NLRP3インフラマソーム活性化に伴うピロトーシスと呼ばれる細胞死が種々の病原細菌の感染と関連していることが示されている。そこで我々はHSC-2単層培養におけるカスパーゼ4、5刺激による非定型NLRP3インフラマソーム活性化による上皮細胞細胞死に関する研究を行った。Esherichia coli LPSのHSC-2細胞へのトランスフェクションは、細胞死を誘導するのに対して、Porphyromonas gingilvalis LPSのトランスフェクションは細胞死を誘導しないことを見出した。さらにマクロファージのTHP-1細胞を用い実験を行った。THP-1細胞においてはエレクトロポレーション法を用いてLPSの細胞質内に配送した。THP-1細胞においては P. gingivalis LPSは細胞死を誘導したが、その活性はE. coli LPSよりも弱かった。THP-1細胞をRT-PCRで解析したところ、カスパーゼ4の発現は認められたが、カスパーゼ5の発現は認められなかったこと、さらに両LPSによるピロトーシスはカスパーゼ4インヒビターで抑制されたことから、THP-1においてはカスパーゼ4が非定型型NLRP3の活性化に関与していると思われた。しかしながら、THP-1細胞をtype I IFNやIFNγで処理するとカスパーゼ５のmRNAのupregulationが観察されたことから歯周炎歯肉においてはカスパーゼ５もなんらかの役割を負っている可能性が推測された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 歯肉扁平上皮細胞腫瘍株のHSC-2とヒト歯肉から採取した線維芽細胞を用いた三次元歯肉再構成モデルの作製を試みたが、歯肉上皮はガン真珠様に重層し、正常な歯肉組織像を示さなかったことから、本実験のモデルとしては適さないと考えられた。そのためヒトプライマリー歯肉上皮細胞を用いた三次元歯肉再構成モデルを作製することとしたが、歯肉上皮細胞の継代・培養が困難であり、十分な細胞数の確保ができなかったため現在、ヒト細胞を用いたモデル作製は頓挫している。さらにコロナウイルス感染症の拡大に伴い、イレギュラーな業務が生じ、実験計画に遅延が生じている。一方HSC-2単層培養を用いた実験では、P. gingivalis LPSのカスパーゼ4活性化能が弱く、上皮細胞死を誘導できないという新しい知見を得ることができ、現在はその現象の基本メカニズムを解明する実験を遂行している。
Strategy for Future Research Activity	歯周病原細菌LPSのカスパーゼ4の活性化能について、P.gingivalisに加えて、Aggregatibacter actinomycetemcomitansやFusobacterium nucleatumのLPSでも実験を行う。またにカスパーゼ4とカスパーゼ1の遺伝子発現を抑制した細胞実験を行い、非定型性NLRP3インフラマソーム活性化によるピロトーシス誘導、また IL-1βプロセッシングにおける、これらの分子の役割を明らかにする予定である。さらにこれらの細菌感染時の細胞応答についても実験を行っていく予定である。
Causes of Carryover	ヒト歯肉上皮ガン細胞もしくはプライマリーヒト歯肉上皮細胞を使用した歯肉3次元構築モデルの作製がうまくできなかったこと、さらにコロナウイルス感染症の拡大からイレギュラーな業務が生じたため計画通りの実験ができなかったため、次年度使用額が生じた。今年度も歯肉単層培養細胞さらにマクロファージ細胞を使用した各種実験を行っていく予定である。