ウスタビガ繭シルクプロテインとiPS細胞による歯槽骨再生技術の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09622
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 菊池 和子 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (40326690)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原田 英光 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (70271210)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 多能性幹細胞 / iPS細胞 / 骨再生

Outline of Annual Research Achievements

歯周組織は、常に口腔内の感染にさらされており，慢性的な炎症が惹起されているので，歯周組織の再生には他の組織再生とは異なり，常に炎症の制御が必要とされる。この研究の目的は，昆虫産物A（物質名は秘匿）がもつ独特の治癒促進効果，抗炎症作用，抗菌性に関する科学的エビデンスを確立するとともに、昆虫産物Aをスキャホールドとして活かすことによって，さらにiPS細胞と併用することによって新規の歯槽骨再生技術を考案することである。そこで，2018年度に昆虫産物Aの治療促進効果，組織学的解析，炎症性メディエーターの発現を評価する実験系の確立のためのマウス皮膚炎モデルを確立した。昆虫産物Aをこの皮膚炎モデルに投与してコントロール群と比較したところ，炎症抑制効果を認めた。2019年度においてこの炎症抑制効果について組織学的解析を進めた結果，治癒促進効果は明確に判定できなかったが毛の再生が有意に亢進していることが認められたが，抗菌作用については証明できなかった。一方で，ヒトiPS細胞を神経堤様細胞（NCLC）を経由して間葉系幹細胞に分化誘導する系，さらには骨芽細胞に分化誘導する系を確立した。また昆虫産物Aから抽出したA’aにおいて大腸菌とカンジダ菌で抗菌作用を調査したが，菌の増殖を有意に抑制する効果は認めなかった。202０年度はさらに別に抽出したA’bにおいても抗菌作用を調査する予定である。加えて昆虫産物AあるいはA’a, A’bをコートしたハイドロキシアパタイトあるいはβ-TCPとの混合物をヌードマウス頭部に移植して骨形成の評価ならびに治癒促進効果について検討する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昆虫産物Aが抗炎症作用を有することを証明するための皮膚炎症モデルマウスの作製は計画通りに進行した。さらに昆虫産物Aを適応した結果，予測通りに抗炎症結果を得ることができたことは2019年度の成果である。この抗炎症効果についての分子メカニズムについて解明は十分に進んでおらず，さらに検討を継続する。抗菌作用について,Aからさらに2つの物質A’a, A’bに分けて検討している段階であるが，抗生物質等と比較して有意義な抗菌効果は得られなかった。組織学的解析から抗炎症作用や組織修復作用は期待できそうであるが，抗菌作用についてはさらなる検討が必要である。この昆虫産物Aのスキャホールドへの適応について2019年度から継続して2020年度も引き続き実施する予定である。またiPS細胞についてはマウスからヒトiPS細胞を用いた実験へ転換して，2020年度はヒト細胞での骨の再生に向けての最終的な評価実験に入る。しかし，基本的分化誘導については概ね予定取りに成功しており，今後この実験の再現性についての検証とスキャホールドへの細胞接着等を検討する実験を行う準備を進めている。以上の成果より，進捗状況は概ね良好であると判断した。

Strategy for Future Research Activity

炎症モデルマウスに対しての昆虫産物A，A’a,　Aｂ抽出物投与法・投与量の検討について検討を行う。さらにiPS細胞移植に伴うスキャホールド（ハイドキシアパタイトあるいはβ-TCP）へのコーティング作用による細胞の接着，移植効果，抗炎症効果等を検討する予定である。抗炎症効果における分子メカニズムの解明として組織標本を作製しH-E染色、炎症性メディエーター（IL-1β, IL-6, TNFα, MMPs, PGE2, MPO, COX-2など）の免疫染色を行い，治癒促進効果と抗炎症効果についての分子生物学的解析を昨年度から継続して行う。また皮膚の炎症治癒に関わる因子として，近年我々が注目しているセマフォリン等の発現についても検討を行う。炎症性細胞としては，T細胞，M1マクロファージとM2マクロファージの細胞分化解析について免疫組織学的解析を行い，抗炎症と治癒に関わる分子メカニズムについて検討する。さらにin vitroにおける昆虫産物Aの抗炎症メカニズムを調べるために、培養口腔粘膜上皮細胞を使った実験を行う。炎症性細胞を上記で検出した炎症性サイトカインにて刺激し、炎症性メディエーターの発現をELISA法で、細胞増殖アッセイや細胞遊走アッセイ,細胞内活性酸素(ROS)測定をCellROX染色によって行う。またカンジダ菌に対しての抗菌効果の判定のための実験を行う。さらに様々な濃度の昆虫産物Aから抽出分離したA’bについても抗菌活性の有無を検討する。2020年度はヒトiPS細胞での骨の再生に向けての最終的な評価実験に入る。骨組織の再生状況と炎症反応の変化についてμCTや血管新生，骨基質タンパクの発現解析などを経時的に観察して評価する。

Causes of Carryover

研究は概ね順調であるが，抗炎症効果については引き続き詳細な解析を必要とする。そのため，炎症性マーカーを判定する免疫組織学的試薬や抗体，またELISAやPCR用の分子生物学的試薬の購入に大部分を使用する。そのための研究費を2020年度に持ち越している。またiPS細胞由来間葉系幹細胞による骨再生のための動物移植実験のための実験動物の購入費用に充てる。2020年度の予算の大部分は研究用の試薬の購入にあてるが，2019年度末はコロナ関係で十分な成果発表ができなかったため，2020年度には学会発表のための旅費にも使用する。