2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞遊走因子LRP1の歯周組織修復環境における機能的役割
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18K09625
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
二宮 禎 日本大学, 歯学部, 准教授 (00360222)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小出 雅則 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (10367617)
中村 浩彰 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50227930)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | LRP1 / 間葉系幹細胞 / 骨組織修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、Lipoprotein receptor related protein-1 (LRP1)が制御するp53関連性細胞遊走機能のメカニズムおよび細胞接着環境を解明することで、新たな組織修復システムの開発を目的とする。そのため、平成30年度は、骨組織修復におけるLRP1陽性細胞の局在およびその細胞性状を検討した。
マウス大腿骨中心部に骨欠損を作製した後、マイクロCTを用いて骨組織修復を経時的に観察した。欠損作製5日目で、骨欠損の骨髄領域に硬組織の形成がわずかに認められた。7日目になると、その硬組織のエリアは拡大され、10日目には皮質骨部位の骨欠損が修復された。組織学的評価においても、マイクロCTと一致しており、硬組織の形成は5日目に認められた。一方、LRP1抗体を用いた組織学的評価において、LRP1陽性細胞は、骨欠損作製3日目に、欠損部位の骨髄腔領域に集積した。その後、徐々にその数は増加し、硬組織周囲のほとんどの細胞がLRP1陽性となった。これらの所見は、骨修復において、LRP1が骨芽細胞系の細胞に作用する可能性を示している。
欠損作製3日目の骨欠損部位から細胞を採取し、Magnetic-activated cell sorting systemによりLRP1陽性細胞を単離した。その単離したLRP1陽性細胞は、LRP1陰性細胞と比べて、CD29, CD105などの間葉系幹細胞(MSCs)マーカーの遺伝子発現が高かった。MSCsおよび骨芽細胞に対して、siRNAによるLRP1のノックダウンは、骨芽細胞分化および骨形成に影響を与えなかった。しかしながら、このLRP1ノックダウンは、これらの細胞の細胞遊走能を抑制した。
以上の結果は、LRP1はMSCsに発現し、骨組織修復のための細胞遊走能に寄与することを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本学の実験動物飼育施設の規模は限りがあり、特に遺伝子改変マウスの飼育エリアは、常に利用者および飼育頭数の調整が必要となっている。したがって、学内における遺伝子組換え実験計画と動物実験計画の認可を取得する前に飼育場所の確保が必須となる。今回、他の実験に使用しているマウスの飼育規模の削減が困難であり、p53遺伝子改変マウスを飼育する場所の確保に時間を要した。そのため、p53遺伝子改変マウスの譲渡手続きを進めることができず、平成30年度の実験予定であったp53とLRP1の関連を検討する実験が滞った。現在、飼育場所の確保および遺伝子組換え実験計画と動物実験計画が認可されており、近日中にp53遺伝子改変マウスが譲渡される予定である。このp53遺伝子が関係する実験以外は、順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度は、間葉系幹細胞(MSCs)におけるLRP1とp53の関係および骨組織修復の微小環境を明らかにするために、以下の実験を遂行する。
1. MSCsの細胞遊走機能におけるLRP1とp53の相互関係を明らかにする。① p53 KOマウスにおけるLRP1陽性MSCsの挙動の検討：p53 KOマウスにおける骨欠損部位を組織学的評価およびFACS解析を行い、LRP1陽性MSCsの細胞挙動や細胞頻度を解析する。② p53とLRP1の関係性の検討：p53 KO MSCsおよびcLRP1 KO MSCsに対して、炎症性サイトカインやPI3K阻害剤AS605240を用いて、p53とLRP1の相関関係を明らかにし、より詳細なMSC遊走機能のメカニズムを解明する。
2. 組織修復の微小環境におけるLRP1の役割を明らかにする。① 微小環境に必須なECMの検討：主要なECMである1型コラーゲン、4型コラーゲン、Fibronectin, Vitronectin, Lamininを1種類または2種類混合したECMのスポットをハイドロゲル上に作製する。そのplate上にLRP1 KO MSCsおよびプラスミドDNA導入によりLRP1を過剰発現したLRP1 Tg MSCsを播種し、それぞれのMSCs接着能を評価する。本実験により、MSCsに適したECMおよび細胞接着におけるLRP1の機能的役割を検討する。② 骨組織修復に適したECMの検討：前実験で決定したECM上でLRP1 KO MSCsおよびLRP1 Tg MSCsを培養し、細胞増殖および骨芽細胞マーカー発現を検索する。
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| Causes of Carryover |
p53 KOマウスの申請および実験計画の認可が遅れているため、このマウスに関する実験が行えていない。また、予定していた第60回歯科基礎医学会への参加を取りやめた。これらの理由より、残金が生じた。
現在、マウス譲渡および実験計画の認可を得ている。平成31年度の助成金と合わせて、マウスの譲渡費用およびp53 KOマウスのLRP1陽性細胞の挙動を検討するためのサイトカインやシグナル阻害剤などの消耗品に加え、FACS解析の費用に使用する。
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