2018 Fiscal Year Research-status Report
骨リモデリング再現系を利用したshRNAスクリーニングによるカップリング解析
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18K09718
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
疋田 温彦 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (60443397)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (30344451)
杉山 円 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (90451814)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 骨リモデリング / スクリーニング / in vitro |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では申請者等の開発した、骨リモデリングin vitro再現系を応用して、shRNAライブラリーあるいは化合物ライブラリーに対するhigh throughputスクリーニング系を構築し、カップリング関連分子を同定し、骨リモデリングin vitro再現系における、2光子励起顕微鏡を用いた経時的観察により、カップリング関連分子の同定とその機能の解明を目的として研究を行う。
平成30年度は、High throughputスクリーニング系の開発を行った。EGFPマウス新生仔由来骨芽細胞を骨芽細胞分化培地で培養し、石灰化結節の形成を確認後、RANK-Cre xROSA-LSL-tdTomatoマウス骨髄マクロファージとの共培養を開始、3週後に再び骨芽細胞分化培地に戻し、さらに3週培養を行った。この系において、共存培養開始時から6週後まで1週毎、計7時点の培養上清を回収し、骨吸収マーカーであるCTX-I，および骨形成マーカーであるPINP、Gla-Osetocalcinに対するELISAを行った。結果としてCTXは骨吸収期に上昇、骨再形成期には低下した。一方、PINPは骨吸収期に低下し、骨再形成期も低下したままであったが、Gla-Osteocalcinは骨吸収期に低下し、骨再形成期に再上昇した。同時に行ったイメージングにおいて、石灰化結節の定量化を行い、経時的な変化を解析した。結果として、石灰化結節の減少、増加を観察しており、ELISAの結果と合致していた。
これらの結果を踏まえ、CTX-IおよびGla-Osteocalcinをそれぞれ骨吸収、骨形成の指標としたスクリーニング系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CTX-IおよびGla-Osteocalcinに対するELISAの結果が、この培養系においてそれぞれ骨吸収、骨再形成を反映していることを確認し、カップリング関連因子に関するスクリーニング系を確立できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
CTX-IおよびGla-Osteocalcinに対するELISAを使用して、High throughputスクリーニングを行う。shRNAレンチウイルスライブラリーの感染、あるいは化合物ライブラリーの添加を行い、スクリーニングによってポジティブクローンを同定する。ポジティブクローンについては、レンチウイルスの場合DNAシークエンシングでshRNAレンチウイルスベクター配列を読み、対応する遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
スクリーニング系の確立に向けた検討が当初の想定より順調に進行したため。
次年度の使用計画については、ELISAキットの購入、shRNAライブラリーあるいは化合物ライブラリーの購入などに使用する。
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