Elucidation of pathogenic acquisition mechanism from the crystal structure of the collagen-binding proteins of Streptococcus mutans

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09735
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 平田 あずみ 大阪医科大学, 医学部, 准教授 (40263587)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高野 和文 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (40346185) ; 田中 俊一 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70591387) ; 野村 良太 大阪大学, 歯学研究科, 准教授 (90437385)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: コラーゲン結合タンパク質 / 機能解析 / Streptococcus mutans / 構造解析

Outline of Annual Research Achievements

Streptococcus mutansが産生するコラーゲン結合タンパク質Cnm/Cbmは約120kDaのタンパク質で、コラーゲン結合ドメイン（CBD）を介してコラーゲンに結合する。この結合メカニズムを解明するために、CBDを構成する4つのドメイン、N1、Linker、N2、Latchに着目し解析を進めてきた。Cnm_CBDの結晶構造解析およびCbm_CBDの予測モデル（SWISS-MODEL）より、Cnm/CbmのN1、N2ドメインはそれぞれ、7つ以下の逆並行βシートが2つのβシートによって挟み込まれたIgG foldとよばれる構造を形成することが明らかとなった。本年は、このような構造をもつN1、N2、それらを繋ぐLinker（-で表記）、Latch（~で表記）の、4つのドメインそれぞれの役割を明らかにすることを目的として、ドメインを組み替えた変異体を作製し、CD測定による安定性測定とELISAによるコラーゲン結合活性測定を行った。作製した変異体は、コラーゲンとの結合能が高いにもかかわらず未知の部分が多いCbm_CBDについての計17種である。CD測定により17種すべての変異体が構造を保っていることが明らかとなり、また、熱安定測定ではN1ドメインに比べN2ドメインの構造安定性が高いことがわかった。さらに、LatchやLinkerをC末端側に持つ変異体の構造安定性が高いことから、LatchやLinkerは構造形成を補助する役割を担うことが示唆された。Ⅰ型コラーゲンとの結合活性測定では、C末端側にN2~、N2-をもつ変異体が高活性を示した一方で、N2のみの変異体は低活性であったことから、N2とそれに続くLatchやLinkerの配列の必要性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①作製したCbm_CBDの17変異体は、Cbm_N1-N2~、Cbm_N1、Cbm_N1-、Cbm_N1-N1、Cbm_N1N1、Cbm_N1-N1~、Cbm_N1-N2、Cbm_-N2~、Cbm_N2-N2~、Cbm_N2-N1~、Cbm_N2-N1、Cbm_N2-N2、Cbm_N2-、Cbm_N2N2~、Cbm_N2~、Cbm_N1N2~、Cbm_N2である。
②LatchとN2の関係を解析するため、Cbm_N2-N2~の結晶化を行っているが、結晶獲得には至っていない。

Strategy for Future Research Activity

①結晶化条件の見直しを行い、Cbm_N2-N2~の結晶化を継続する。
②N1非存在下でのN2とLatchとの関係を明らかにするため、Cbm_N2~の結晶化を行う。
③変異体Cbm_-N2、Cbm_N1~を作製し、LinkerやLatchの役割を明らかにする。

Causes of Carryover

（理由）本年度は変異体の作製作業を主に行ったため、試薬等の新規購入の必要性が低かったことによる。

（使用計画）次年度は、変異体の追加作製に加え、数種類の変異体の結晶化を予定している。結晶化用の試薬は高価なものが多く、そのための経費として充当する予定である。