2019 Fiscal Year Research-status Report

唾液腺腫瘍の低酸素応答性増殖機構を標的とした抗腫瘍治療法の創出

Research Project

Project/Area Number	18K09740
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	丸山智新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (30397161)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山崎学新潟大学, 医歯学系, 助教 (10547516) 田沼順一新潟大学, 医歯学系, 教授 (20305139)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	唾液腺多形腺腫 / 低酸素 / HIF-1α
Outline of Annual Research Achievements	1) SM-AP細胞系のHIF-1α遺伝子発現抑制によるECM発現動態の検証：HIF-1αがSM-AP細胞系のECM発現動態にどのように関わっているのかを検討するために、siRNAを用いてHIF-1α発現を抑制したSM-AP細胞系からRNAを抽出・精製し、cDNAを調整して定量的RT-PCR法にて、ECM分子の一つであるperlecanやfibronectinの発現を比較した。その結果、SM-AP1細胞系のHIF-1αの発現を抑制することで、perlecanやfibronectinの発現も抑制される傾向があることが示された。 2) 細胞増殖関連液性因子の網羅的解析：昨年度の細胞増殖関連液性因子の網羅的解析から、低酸素培養条件下でemmprinやangiogeninの発現が増加することが確認できたので、SM-AP1細胞系をヌードマウス背部皮下に移植して形成させた腫瘍組織を切除、固定後にパラフィン切片を作製し、免疫組織化学的に検討した。その結果、腫瘍組織内のSM-AP1細胞の核にHIF-1α陽性細胞にemmprinの発現もみられることがわかった。 3) CD73の発現動態及び腫瘍細胞の機能評価: 低酸素培養条件下におけるSM-AP1とSM-AP4のCD73遺伝子発現について試験管内で比較した。両細胞を通常の培養条件と低酸素条件（1％O２/5％CO２/94％N２）で48時間培養の後、RNAを抽出・精製し、cDNAを調整して定量的RT-PCR法にて検討した。その結果、SM-AP1/4ともに通常の培養条件下に比べて高発現が確認された。さらにトランスウエルチャンバーに細胞をまきなおした後、通常の培養条件と低酸素条件（1％O２/5％CO２/94％N２）で24時間培養後の細胞遊走能を比較したところ、SM-AP1/4ともに、細胞の遊走能が促進される傾向にあることがわかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度はSM-AP細胞系を用いたHIF-1α遺伝子発現抑制による細胞機能解析で、細胞の増殖と遊走が抑制されたことから、低酸素下でのSM-AP細胞系の増殖や維持にHIF-1αの活性化が関係していることが示唆された。さらに本年度は低酸素下でCD73遺伝子発現が亢進し、細胞の遊走能が促進される傾向が示されたとともに、SM-AP細胞移植腫瘤でSM-AP1細胞の核にHIF-1αが陽性となるとともに、同細胞にCD73およびemmprinの発現がみられることも確認できたことから、これらの分子の機能解析を進めることで、HIF-1αの活性化に依存した細胞の増殖や維持に重要な低酸素応答性増殖機構の分子機構の解明に繋げられると想定された。
Strategy for Future Research Activity	現在、低酸素下でのCD73が細胞機能にどのように関わっているのかをより検討するために、SM-AP細胞系にsiRNAを用いたCD73発現を抑制した系を作成し、SM-AP細胞系の増殖および遊走能の比較検討をおこなっている。また低酸素下でのSM-AP細胞系におけるCD73およびemmprinの発現パタンの解析を進めて、より詳細な細胞局在を検討する。さらにヒト腫瘍組織材料を用いた免疫組織学的解析も進め、実験結果の評価および研究の総括をおこなう予定である。
Causes of Carryover	本年度は予定していたヒト腫瘍組織材料を用いた組織学的解析についての検討が進められなかったため、次年度にそのために必要な試薬等の購入費用を繰り越した。