2018 Fiscal Year Research-status Report
歯の形成におけるRUNX2によるCTGF/CCN2発現調節機構の解析
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18K09743
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
森谷 徳文 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (60467751)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063)
久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936)
高畠 清文 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (70736537)
星島 光博 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (30736567)
松村 達志 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (70432648)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | CTGF/CCN2 / RUNX2 / tooth formation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鎖骨頭蓋異形成症の9歳女児および母親の末梢静脈から血液を採取後，DNAを抽出し，ダイレクトシークエンス法によりRUNX2の8つのexonの塩基配列を決定した．この塩基配列を対照の健常者およびGenBankの配列と比較してRUNX2遺伝子変異解析を行った結果，母子共にRUNX2遺伝子のexon8内，1205塩基目のシトシンが欠失し（c.1205delC），フレームシフト変異していたことを同定した．患児の臨床症状では，両側鎖骨低形成，大泉門閉鎖遅延，低身長，歯の萌出遅延，過剰埋伏歯などを認め，母親も同様の既往であった．我々が渉猟した範囲では，c.1205delC変異報告例を1例認めたが臨床症状の報告はなかった．そのため同変異による臨床症状の差異は検討できなかったが，本報告は鎖骨頭蓋異形成症の遺伝子型と表現型との比較検討に有用であると考えられた．
また同患者より抜去した過剰埋伏歯および正常な対象者から便宜抜去した正常萌出小臼歯おけるRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在を明らかにし比較解析した．その結果正常萌出小臼歯ではRUNX2とCTGF/CCN2は象牙芽細胞および歯髄細胞に発現が認められた．一方で鎖骨頭蓋異形成症の埋伏過剰歯では， RUNX2は象牙芽細胞に，CTGF/CCN2は象牙芽細胞と象牙前室に発現が認められた．このように鎖骨頭蓋異形成症と正常対象者とを比較するとRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在に若干の変化が認められた．
これらの結果とRUNX2の遺伝子変異による発現変化によってCCN2のタンパク質発現も変化するという過去の報告から，歯の形成においてCCN2はRUNX2の調節下で歯の形成を調節する因子として働いている可能性が示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に計画していた計画が，ほぼ予定通りに達成された．
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| Strategy for Future Research Activity |
１）RUNX2によるCTGF/CCN2発現調節の証明とRUNX2と相互作用してCTGF/CCN2発現調節を行う新規因子の同定；CTGF/CCN2およびRUNX2の発現を確認済みのヒト骨芽細胞様細胞株Saos-2を使用して解析する．
①RUNX2発現をRNAiによるmRNAのknockdownおよびDNA transfectionによる強制遺伝子発現の手法を用いて変動させ，CTGF/CCN2の発現変化を解析する． CTGF/CCN2発現がRNAiにより抑制され，DNA transfectionにより促進されればRUNX2がCTGF/CCN2を正に発現調節を行っていることが証明される．
２）CTGF/CCN2発現調節を行うRUNX2タンパク質の機能領域の特定；CTGF/CCN2およびRUNX2の発現のないサル腎臓由来細胞Cos-7細胞株を使用して解析する.
① 推定されたRUNX2機能領域情報に基づき，RUNX2遺伝子の全長および機能領域と推定される部分の発現ベクターを作成し，Cos-7細胞にDNA transfectionして強制遺伝子発現させ，Cos-7細胞のendogenousなCTGF/CCN2遺伝子が反応してCTGF/CCN2発現が変化するか否かを確認する．
② ①で機能が確認された領域の遺伝子配列の変異体を作成し，２）－①と同様の解析を行ってRUNX2機能領域を特定する．
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| Causes of Carryover |
すでにあった試薬，実験キット，実験器具を使用し研究計画を進められたため，消耗品購入金額が当初の予定よりも，かなり低く抑えられたために平成30年度の残額が発生した．次年度には，短期ではあるが海外にて研究を行う予定のため，平成30年度に発生した残額は，海外への渡航費に使用する計画である．
①細胞培養関連，組織染色関連の試薬・抗体 ②遺伝子発現解析，RNA干渉，遺伝子強制発現，マイクロアレイ法による発現解析などの実験系に必要なoligonucleotide等の合成DNA・RNA ③実験の大部分において使用する実験器具 ④実験に関わるプラスティック器具 ⑤実験データの整理，統計処理，文献整理に対してのソフトウェア ⑥実験用動物，以上の①～⑥を消耗品として使用する計画である．国内旅費としては歯科基礎医学会，日本分子生物学会，日本骨代謝学会，日本軟骨代謝学会，日本生化学会，口腔外科学会などの中より必要な学会を選択して調査・発表を計画している．人件費・謝金として，研究成果発表費用としての英語論文の校正料や学会誌投稿料金を，その他として資料収集や研究成果発表のため通信費，印刷費，複写費を使用する計画である．
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