2019 Fiscal Year Research-status Report

歯の形成におけるRUNX2によるCTGF/CCN2発現調節機構の解析

Research Project

Project/Area Number	18K09743
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	森谷徳文岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (60467751)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	滝川正春岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063) 久保田聡岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936) 高畠清文岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (70736537) 星島光博岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (30736567) 松村達志岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (70432648)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	CTGF/CCN2 / RUNX2 / tooth formation
Outline of Annual Research Achievements	鎖骨頭蓋異形成症の患者より抜去した過剰埋伏歯および正常な対象者から便宜抜去した正常萌出小臼歯におけるRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在を明らかにし比較解析した．その結果正常萌出小臼歯ではRUNX2とCTGF/CCN2は象牙芽細胞および歯髄細胞に発現が認められた．一方で鎖骨頭蓋異形成症の埋伏過剰歯では， RUNX2は象牙芽細胞に，CTGF/CCN2は象牙芽細胞と象牙前質に発現が認められた．このように鎖骨頭蓋異形成症と正常対象者とを比較するとRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在に若干の変化が認められた．この結果とRUNX2の遺伝子変異による発現変化によってCCN2のタンパク質発現も変化するという過去の報告から，歯の形成においてCCN2はRUNX2の調節下で歯の形成を調節する因子として働いている可能性が示唆された．一方，我々は軟骨肉腫患者から細胞を採取して樹立したHCS-2/8細胞を使用して，これにRARgのアゴニストを作用させるとHCS-2/8細胞の成長を阻害することをin vitroで証明し，また実験動物において形成された軟骨肉腫にRARgのアゴニストを作用させると腫瘍の成長を阻害することをin vivoにおいても証明した．その結果，軟骨肉腫の治療において，RARgのアゴニストを使用すると腫瘍の成長を阻害することを実験的に証明し英語論文にて発表した．また，この一連の研究過程においてRARgのアゴニストがCCN2およびRUNX2の遺伝子発現を調節することが分かり，軟骨細胞においてもRUNX2がCCN2の発現調節に関与している可能性が示唆された．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 実験計画を進めていく中で分かった新たな結果を検討することに時間が取られ，本来の実験計画に沿った内容を進めることが遅れてしまった．
Strategy for Future Research Activity	１）RUNX2によるCTGF/CCN2発現調節の証明とRUNX2と相互作用してCTGF/CCN2発現調節を行う新規因子の同定；CTGF/CCN2およびRUNX2の発現を確認済みのヒト骨芽細胞様細胞株Saos-2を使用して解析する． ①RUNX2発現をRNAiによるmRNAのknockdownおよびDNA transfectionによる強制遺伝子発現の手法を用いて変動させ，CTGF/CCN2の発現変化を解析する． CTGF/CCN2発現がRNAiにより抑制され，DNA transfectionにより促進されればRUNX2がCTGF/CCN2を正に発現調節を行っていることが証明される．２）CTGF/CCN2発現調節を行うRUNX2タンパク質の機能領域の特定；CTGF/CCN2およびRUNX2の発現のないサル腎臓由来細胞Cos-7細胞株を使用して解析する. ① 推定されたRUNX2機能領域情報に基づき，RUNX2遺伝子の全長および機能領域と推定される部分の発現ベクターを作成し，Cos-7細胞にDNA transfectionして強制遺伝子発現させ，Cos-7細胞のendogenousなCTGF/CCN2遺伝子が反応してCTGF/CCN2発現が変化するか否かを確認する． ② ①で機能が確認された領域の遺伝子配列の変異体を作成し，２）－①と同様の解析を行ってRUNX2機能領域を特定する．
Causes of Carryover	海外で行った研究において使用する予定であった金額を予定よりも低く抑えられたため，平成31年度の残額が発生した．次年度には，積極的に国内，海外での調査，発表を行い，また論文を投稿するためなどに研究費を使用したいと考えている．