2019 Fiscal Year Research-status Report

Golin症候群由来iPS細胞を用いた歯原性角化嚢胞モデルの樹立とその応用

Research Project

Project/Area Number	18K09753
Research Institution	Tokyo Dental College
Principal Investigator	小野寺晶子東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90637662)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中村貴東京歯科大学, 歯学部, 講師 (80431948) 齋藤暁子東京歯科大学, 歯学部, 助教 (90722835)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	Gorlin症候群 / 疾患特異的iPSC / 歯原性角化嚢胞
Outline of Annual Research Achievements	ヘッジホッグ受容体であるPTCH1の機能喪失変異はGorlin症候群を引き起こし、中でも顎骨内に生じる歯原性角化嚢胞（OKC）は手術後の再発もあり、患者に大きな負担を強いている。しかしながらPTCH1の変異によるGorlin症候群の発症メカニズムの詳細は不明でありOKCの根本的かつ患者負担の小さい治療法も確立されていない。申請者はこれまでGorlin患者から樹立したiPS細胞を用い、PTCH1と他のヘッジホッグ受容体であるPTCH2,BOCの多重変異がヘッジホッグシグナル活性を変化させ、それにより表現型の多様性を生み出すことを明らかにしてきた。本研究ではこれまでの知見をもとに、樹立したGorlin症候群iPS細胞を用いて、OKC3次元モデルを新たに構築し、OKC発症の分子メカニズムの解明と化合物ライブラリーを用いた有効薬候補のスクリーニングを行う。これまでに樹立した1症例のiPS細胞からゲノム編集技術を用いてその遺伝子変異を修復したコントールiPS細胞を作製した。遺伝子編集をしたコントールiPS細胞では遺伝子編集前と同様の未分化性および多能性を確認した。コントロールiPS細胞ではGorlin症候群iPSと比べ変異を有するアリルの発現減少が認められ、Hh経路のターゲット遺伝子であるHHIPおよびGLI1の発現減少が認められた。GolriniPS細胞より分化した基底細胞では、コントロール細胞に比べ、HhシグナルのターゲットであるGLI1,HHIPの上昇がみとめられた。またUVC照射実験により、Golrin症候群iPS細胞ではコントロール細胞に比べアポトーシス抵抗性を有することが確認された。OKCを対象とした遺伝子解析では遺伝子変異の同定が終了しており、嚢胞においても多くの変異が存在することが確認された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason H30年度に予定していたゲノム編集を用いたコントロールiPS細胞に成功した。現在他のクローンについても遺伝子編集クローンの作成を試みてる。また歯原性角化嚢胞の発症原基であると考えられる基底細胞への分化も並行して行っており、Gorlin症候群iPS細胞から分化した基底細胞ではマーカであるKeratin14,integlinβ4の発現が確認された。この細胞を用いて今後さらに詳細な機能解析を行うことが可能である。
Strategy for Future Research Activity	遺伝子編集を行ったiPS細胞をコントロール細胞とし、梶原らによって樹立された基底細胞への分化方法を用いる(Stem Cell Reports. 2017;8(6):1701-1713.)。 iPS細胞をVitronectin/collagenコートディッシュで播種、keratinocyte-SFM（Gibco）にレチノイン酸、BMP4、を加え4日間培養後、同一培地にEGFを添加し30日培養し上皮細胞を得る。分化の確認には基底細胞分化マーカーであるKeratin14,Integrin4のmRNAおよびタンパクの発現を用いて確認する。Laminin含有Matrigelに懸濁しWnt agonistのR-spondin1を添加し(Sato T et al. Nature, 2009;459(7244):262-5)、in vitroで嚢胞形成する。Matrigelに懸濁した上皮様分化細胞を免疫不全マウス皮下に移植しin vivoで嚢胞形成を検討し、その形態、上皮様構造構成タンパク質発現の違いを検討し、寄与遺伝子変異を同定する。