2018 Fiscal Year Research-status Report
低酸素応答性転写抑制因子DECを標的としたがん分子標的治療法開発研究
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18K09768
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
谷本 圭司 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助教 (90335688)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 低酸素応答 / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請研究は，治療抵抗性を示す口腔がんなどに対する新しい抗がん戦略として，低酸素環境下で誘導され， DNA損傷応答やアポトーシスを司る転写因子DEC1およびDEC2の抗がん分子標的としての可能性を検討するとともに，その制御分子機構を明らかにし，制御化合物（薬）のスクリーニングまで展開することを目的として開始した。すなわち，転写因子DEC応答配列を用いたレポーターによるスクリーニング実験系を確立し，siRNAライブラリーを用いたDEC制御遺伝子群の同定および機能解析，さらに，同実験系を用いたDEC制御化合物（薬）スクリーニングまで応用展開し，将来的な治療法（薬）開発を目指している。
初年度は，スクリーニング実験系の確立を目標に，DEC1やDEC2により抑制されるDNA損傷応答遺伝子プロモーターの中からMLH1遺伝子プロモーターを選び，ルシフェラーゼおよびGFPレポーターを作製し，いくつかのがん細胞株を用いて，DEC1やDEC2の応答性，特異性の確認をした。現在，作製したレポーターをHSC2口腔がん細胞に安定遺伝子導入し，FACSによるセルソーティング，レポーター実験による活性確認を行い応答性の高い細胞クローンの選定作業中である。さらに，DEC1およびDEC2のcDNAをサブクローニングし，Tet-Onシステムを用いた発現誘導性の遺伝子安定導入株をHSC2を用いて作製中である。一方，ゲノム編集（TALEN）を用いて，内在性DEC1およびDEC2にGFP遺伝子を組み込んで，蛍光タンパク融合DEC発現細胞の作製を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DEC応答配列レポーター作製，Tet-On DEC発現誘導プラスミドベクター作製，およびそれらの安定遺伝子導入細胞株の作製は順調に進めており，今年度はそれらを用いた，スクリーニング実験を開始する予定であり，概ね順調に進展していると考えている。一方，ゲノム編集（TALEN）を用いて，内在性DEC1およびDEC2にGFP遺伝子を組み込んで，蛍光タンパク融合DEC発現細胞の作製する過程において，DEC2ターゲティングプラスミドベクター作製が困難に遭遇している。DEC2遺伝子の３’領域は非常にGCリッチな構造をしており，PCRによる正確な増幅が難しい。しかしながら，現在では，多くのCGリッチ配列に対応した酵素が販売されており，現在，いくつかの新製品を入手し，改善を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後，作製したレポーターをHSC2のみならず，その他の口腔がん細胞や他種のがん細胞，KDなどの正常細胞に安定遺伝子導入し，FACSによるセルソーティング，レポーター実験による活性確認を行い応答性の高い細胞クローンを製する。同時に，DEC誘導性発現細胞株，TALENを用いたDECレポーター細胞などを並行して作製する。
次に，今年度中に，作製したうち最も反応性の高い細胞クローンを96ウェルプレートに播種した後，所属研究所所有のヒトゲノムsiRNAライブラリーを導入し，細胞を通常酸素または低酸素環境下にて培養する。その後，レポーター活性をIN CELL ANALYSERにて測定して，DEC制御活性に影響を与える遺伝子群を同定する。
並行して，上記のスクリーニングにて同定された遺伝子群から，反応性上位の遺伝子に関しては，同定遺伝子siRNAによるDEC制御活性を個別に検証し，また，様々ながん細胞株（口腔，肺，乳がんなど）を用いて，その普遍性，特異性を評価する。また，それらがん細胞の増殖能，浸潤能，遊走能，放射線や抗がん剤感受性などに関して，同定遺伝子siRNAによる影響を評価し，さらに，それらの機能発現にDECが必要か，DEC抑制細胞を用いて検討し，その分子標的としての重要性検討を行う。さらに，DEC制御分子としての重要性が示された分子に関しては，その機能解析も行う，siRNAによる機能抑制に加えて，高発現細胞を作製し，細胞機能に与える影響を上記同様検討すると共に，RNAseqなどによりその機能を網羅的に解析し，同分子，DEC経路の抑制が細胞，生体に与える影響を予測する。
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