2019 Fiscal Year Research-status Report
Mechanisms involved in regulation of osteoclastogenesis by glucan through autophagy
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18K09797
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| Research Institution | Kyushu Dental College |
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Principal Investigator |
有吉 渉 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (40405551)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / 炎症性骨破壊 / β-glucan / dectin-1 / オートファジー / エンドサイトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖鎖β-glucanの1つcurdlanが、破骨細胞前駆細胞に特異的に発現しているパターン認識受容体dectin-1に作用して、破骨細胞分化や骨吸収活性を抑制することを見出した。さらに、その抑制メカニズムとして、非受容体型チロシンキナーゼであるspleentyrosine kinase (syk)のタンパク発現抑制が関与していることを証明した。興味深いことに、この負の制御は、遺伝子レベルの発現抑制を介さず、細胞質タンパクの代謝に中心的な役割を果たすオートファジーによるタンパク分解機構が関与することが示唆された。そこで今回、β-glucanとdectin-1との相互作用の結果、誘導されるオートファジーによる破骨細胞の分化抑制メカニズムの全容を明らかにすることを目的として詳細な解析を展開する。そこで得られた知見をもとに、未だ不明な点が多い自然免疫系による骨代謝制御機構を明らかにするとともに、破骨細胞に選択的な治療効果を示す創薬の開発を目指す。
dectin-1を過剰発現させた破骨細胞前駆細胞に対するcurdlanの刺激によって、dectin-1およびsykタンパクのオートファジーを介した分解が誘導されるが、この誘導にはクラスリン、カベオラ、さらには脂質ラフト依存性エンドサイトーシス機構が必要であることが見出された。さらに、curdlan刺激による小胞体ストレスセンサーの1つInositol requiring 1（IRE1）や破骨細胞分化の種々のnegative regulatorの発現亢進も観察され、オートファゴソームによるバルク分解系の誘導調節に、種々の分子メカニズムが関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書において2019年度は、「curdlanによるオートファジー誘導へのエンドサイトーシスの関与の解明」を目的に研究を行った。破骨細胞前駆細胞に対するsucroseによるクラスリン依存性、methyl-β-cyclodexitrinによるカベオラおよび脂質ラフト依存性エンドサイトーシスの阻害より、curdlanに誘導されるsykタンパクの分解の回復が見出されたことから、curdlanによるオートファジーを介した分解系の誘導にエンドサイトーシスが関与していることが示唆された。そこで、curdlan添加後の破骨細胞前駆細胞を蛍光顕微鏡視下に観察したところ、dectin-1、sykともにクラスリンとカベオリンとの共局在が観察され、上記の示唆を支持するデータが得られた。
さらにcurdlanの添加により、小胞体ストレスセンサーであるIRE1や破骨細胞分化のneagtive regulatorである転写因子IRF8の発現亢進が観察されたことから、免疫受容体を介した破骨細胞分化制御にはオートファジーとともに様々な調節機構が関与していることを証明することができた。今後もさらに検証を追加することで、骨と免疫系の相互作用にフォーカスした融合領域である「骨免疫学」研究の加速化・重層化・統合化へと繋がっていくものと考えている。
さらにβ-glucanとして、curdlan以外のβ-glucanであるlaminarin、lichenan、glucan from baker’s yeast、β-1-3-glucan from Euglema gracisについても、破骨細胞分化抑制能が示されたが、その分子メカニズムにはβ-glucanの間で一部相違があった。今後、各種β- glucanのキャラクタリゼーションについて物質化学の観点からの解析も追加していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
オートファジーとエンドサイトーシスの関与の観点から、詳細なメンブレントラフィック経路の解明のため、分解のターゲットであるsykとともに、初期及び後期エンドソームを標識し、これらの細胞内動態を観察する。さらに、メンブレントラフィック制御に関わる新規遺伝子同定のため、培養後の細胞よりcDNA libraryを作製し、シーケンサーによる配列解析と遺伝子発現解析を行い、未知の転写産物の発現量について検証する。見出された候補遺伝子については、同様の培養を行った細胞より、RNAを抽出し、Real-Time RT-PCR法を用いて、遺伝子発現の有無と発現誘導の同定を行う。
一方、小胞体ストレス応答においては、IRE1は異常タンパクを感知すると立体構造が変化し、転写因子である活性型XBP1が産生される。β-glucanによるIRE1発現増強の小胞体ストレス応答への関与について、XBP1、Ask1とJNKの活性化について解析する。関与が示唆された経路については、ノックダウン実験を行い、破骨細胞分化への影響を確認する。
さらに、curdlanによる破骨細胞分化のneagtive regulatorの発現誘導メカニズムに関しては、その発現を制御する転写因子であるBlimp1にフォーカスし、免疫受容体であるdectin-1 下流のシグナルがこれらの調節に関与しているという仮説のもとに詳細な分子メカニズムの解明を行う。
加えて、将来的な臨床応用を踏まえ、卵巣摘出骨粗鬆症モデルマウスに対して、curdlan の投与を行い、非脱灰組織標本を作成後、一般染色、酵素染色を行った上で、骨吸収パラメータや骨形成パラメータ、動的パラメータを定量する。
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| Causes of Carryover |
オートファジーとエンドサイトーシスの協調に関する分子機構の解明について、当初購入を予定していた研究試薬の購入費が少なく済んだためである。翌年度は追加の検討事項として、小胞体ストレスおよび破骨細胞分化のnegatve regulatorの発現制御機構の解明も必要となるため、同研究に必要な試薬購入費として、計上する。
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