超遠心法による分画抽出血清を用いた新規硬組織形成誘導法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09834
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 上田 公子 (山口公子) 徳島大学, 病院, 助教 (40335807)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩本 勉 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (90346916) ; 北村 尚正 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 助教 (50614020) ; 赤澤 友基 徳島大学, 病院, 助教 (10646152)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ウシ胎児血清 / 超遠心 / 歯原性上皮細胞 / 歯原性間葉細胞 / 増殖 / 分化

Outline of Annual Research Achievements

令和元年度も，硬組織形成細胞の増殖と分化に対する、超遠心法により得られたウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum : 以下FBS)分画の影響を検討することから研究を開始した。
FBSは，超遠心分離機にて100,000g×18時間超遠心し，3層に分かれた分画をそれぞれ回収し，最上方を第1層，中間層を第2層，最下層を第3層として使用した。
まず，歯原性間葉細胞(mDP)を用いて、分化について検討するためアリザリンレッド染色を行った。平成30年度に，10%FBS中に各分画を5%含む培地にて同様の実験を行い，第1層の使用で，通常より早い時期に石灰化が開始する傾向を認めたことより，最も効果的な第1層の使用量を確認することにした。まず，10%FBS中に各分画を8％含むFBSを使用し，同様の実験を行った。しかし，結果は安定しなかった。次に，第1層を1%，2%，3%，4%，5%，10%含む培地を使用し，同様の実験を行った。結果は第1層を5%含む培地の使用で通常より最も早い時期に石灰化が開始することを確認できた。
次に，FBSのLotを変更して，歯原性間葉細胞(mDP)を用いて，再度，増殖試験を行った。細胞カウントの結果，コントロールと比較して，第1層の使用で，細胞増殖は有意に抑制され，第3層の使用で細胞増殖が有意に促進された。第2層の使用はコントロールと有意差を認めなかった。増殖試験での第1層，第3層の効果は，FBSのLotを変更しても，同様に得られたが，第2層については，FBSのLotの違いにより，結果にばらつきがある可能性が示唆された。
これらの結果から，超遠心法により得られたFBS分画は硬組織形成細胞の増殖や分化に好影響を与える可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

令和元年度は，硬組織形成細胞として、骨芽細胞株、軟骨細胞株、歯原性間葉細胞株、歯原性上皮細胞株を用いて，硬組織形成を促進する因子の同定を目指す予定であった。
まず，歯原性間葉細胞株を用いて分化についての影響を確認するための実験を開始した。第1層の使用で，早期から石灰化が開始される傾向を認めたものの，結果が安定せず，歯原性間葉細胞の石灰化の評価について，明らかな結果を得ることに時間を要した。
また，歯原性間葉細胞株を用いた細胞増殖についての実験では，FBSのLotを変更したところ，第1層の使用により，かなり極端に細胞増殖が抑制され，当初は何らかの実験上のエラーと考えたこともあり，Lotの違いで細胞増殖が極端に抑制されたとの結果にいたるまでに時間を要した。
歯原性間葉細胞と歯原性上皮細胞の増殖と分化について，超遠心したFBS各分画の影響を十分に確認後，細胞遊走試験やその他の骨芽細胞株、軟骨細胞株を用いた実験，硬組織形成細胞へのリポ蛋白（HDL、LDL、超低比重リポ蛋白(VLDL)、カイロミクロン）の影響の検討を予定していたため，歯原性間葉細胞への各分画の分化への影響やLotの違いによる増殖への影響の確認に時間を要してしまい，硬組織形成を促進する因子を同定するための実験ができなかった。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度の研究で，超遠心法により得られたFBS分画の歯原性間葉細胞への増殖や分化に対する効果について，第1層は石灰化を促進し，第3層は増殖を促進する所見が得られたため，令和2年度は，各分画のタンパク成分の検索を行い，各分画間で蛋白成分の差があるかどうかを確認することから実験を開始する。
それと並行して，骨芽細胞株や軟骨細胞株についても，超遠心法により得られたFBS分画の増殖や分化に与える影響を確認する，FBSのLotの違いによる影響も検討する。
各硬組織形成細胞へのリポ蛋白（HDL、LDL、超低比重リポ蛋白(VLDL)、カイロミクロン）の影響を，増殖試験（細胞カウント、BrdU）、ALP活性、アリザリンレッド染色、細胞遊走試験にて検討する。これらの試験により、目指す因子が同定されない場合にはさらにFBSの他の成分について網羅的に検討し、硬組織形成細胞の増殖や分化を促進する分子の同定を行う。
併せて，令和2年度の研究では，Western blotting法やreal time RT-PCR法を用い、それぞれの細胞に発現するタンパクや遺伝子の解析を行い、硬組織形成促進のメカニズムを解明する。
また，効果的な石灰化誘導法の開発や効率的な硬組織形成の促進方法の開発を目指し,細胞培養系や、頭蓋冠開削モデルまたは歯の歯髄露髄モデルマウスを用いて、石灰化誘導促進効果や硬組織再生促進効果について検討を行い、臨床応用を目指す研究を実践したい。

Causes of Carryover

令和元年度の研究では，超遠心法により得られたFBS分画の歯原性間葉細胞の石灰化への影響の評価に時間を要し，細胞遊走試験やその他の骨芽細胞株、軟骨細胞株を用いた実験が進まなかった。また，各硬組織形成細胞へのリポ蛋白（HDL、LDL、超低比重リポ蛋白(VLDL)、カイロミクロン）の影響について検討できなかった。さらに，これらの試験により、目指す因子が同定されない場合には，FBSの他の成分について網羅的に検討し、硬組織形成細胞の増殖や分化を促進する分子の同定を行う予定であったが，こちらも実行できなかった。以上により，次年度使用額が生じたと考えられる。
令和2年度の研究では，令和元年度予定していた上記の研究に加えて，硬組織形成促進のメカニズムを解明するため，Western blotting法やreal time RT-PCR法を用い、それぞれの細胞に発現するタンパクや遺伝子の解析を行うとともに，効果的な石灰化誘導法の開発や効率的な硬組織形成の促進方法の開発を目指し,細胞培養系や、頭蓋冠開削モデルまたは歯の歯髄露髄モデルマウスを用いて、石灰化誘導促進効果や硬組織再生促進効果について検討を行い、臨床応用を目指す研究を実践する。このため，次年度使用額については，実験の消耗品として使用予定である。