2018 Fiscal Year Research-status Report
ブドウ球菌属の耐性獲得と水平伝播の背景は？：可動性遺伝因子の構造比較
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18K10055
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
漆原 範子 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (80396308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
アウン メイジソウ 札幌医科大学, 医学部, 助教 (10749584)
小林 宣道 札幌医科大学, 医学部, 教授 (80186759)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | MRSA / SCCmec / 薬剤耐性 / ACME / ポリアミン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Staphylococcus Cassette Chromosome （SCC）はブドウ球菌ゲノムに共通の可動性遺伝子エレメントで，両端を直接反復配列（DR）に囲まれ，内部に組換え酵素(cassette chromosome recombinase: ccr)を持つ。組換え酵素 CCR は DR を認識し，SCC の挿入・切り出しを行う。SCC が複数連結した形で挿入される場合もあり，SCC-composite islands（SCC 複合体）と呼ばれる。代表的な SCC として，メチシリン耐性を担うmecA をコードする SCCmec が知られている。SCCmec は，mec 周辺の遺伝子構造（mec complex）と，ccr 遺伝子の多様性を組み合わせることにより型別を決定する手法が確立しており，ブドウ球菌の分子疫学解析に広く用いられている。
他方 non-mec SCC にも多様な耐性遺伝子（あるいは耐性遺伝子と類似の配列）が多くコードされている。アルギニン代謝系酵素遺伝子群 arc を持つ SCC として arginine catabolic mobile element（ACME）があり，宿主菌体に低 pH 耐性を付与する。市中感染型 MRSA の中で最も広範囲に分布するクローンとして USA300 が知られている。USA300 ゲノムに特徴的に見いだされる ACME は，スペルミジンＮ－アセチル転移酵素遺伝子（speG）も同 SCC 内にコードしているため，ヒトのケラチノサイトから産生されるポリアミンへの耐性も獲得しており，それら二つの形質により，USA300 は皮膚・皮膚軟部組織で優位に定着・生存できるものと考えられている。
本年度は，北海道内の医療施設から分離された MRSA菌体のうち，arc 陽性，かつspeG 陽性の３株 SCC 複合体の配列を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
解析に用いた MRSA（SC640，SC792， SC955）はいずれも遺伝子型 ST5 に属し，speG 陽性あること，かつ arc は ACME II’（arc と周辺配列のみを含む短縮型の ACME）に含まれることは既報で報告した。
次世代シーケンス法を用い，これらの全ゲノム配列を決定した。得られたリードを de novo assemble を行った後，サンガー法によりギャップクローズを行い，SCC 複合体の完全長を決定した。ORF 予測，BLAST 解析を行い，以下に記す新規の SCC 遺伝子構造を明らかにすることができた。
いずれの株も speG 遺伝子は ACME II’ではなく，隣接した異なる SCC 内にコードされていた。遺伝子配列の相同性から，それらの SCC は S. epidermidis の SCC から進化した新たな構造と考えられた。SC640，SC792 の SCCmec は既報には無い mec complex と ccr 遺伝子の組合せであり，SCC の命名を担う国際委員会により，新たなSCCmec XIV 型と認定された。中でもSC640 は mec complex 以降のほとんどの配列を欠いており，染色体との接合部位にある DR も欠いていた。組換え酵素 CCR の認識配列である DR 配列を失っていることから，切り出しを受けないとの予測がなされたが, PCR を用いた予備的解析ではそれに矛盾しない結果を得ている。
以上の結果より, MRSA の中で SCC の遺伝子再編が進行中であり，それにより新たな耐性や形質が付与される可能性が示唆された。また，比較遺伝子研究から S. epidermidis 等のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌がそれらの供給源であるという現在の仮説に矛盾しない結果と考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
① SC640 に見られた染色体 DNA との接合部分の DR 配列を欠いた構造について，可動性の有無をより定量的に測ることを試みる。
② 上記 SCC 複合体に見られた新規配列の由来を探る。S. epidermidis や S. haemolyticus のゲノムを対象として類似の配列を探索する。
③ speG 遺伝子をもつ上記の分離株が USA300 での調査結果と同様にポリアミン耐性を発揮するか検討する。
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| Causes of Carryover |
濁度測定を用いた菌対数測定器（往復振とう培養用非接触濁度計）の購入費として 380,000 円を計上した。その後，濁度ではなく，ハウスキーピング遺伝子を対象としたデジタル PCR 法を用いた菌体数の計測を考え，平成 30 年度は濁度計の購入を見合わせたため残額が生じた。デジタル PCR の機器は本学の共通機器として備えられており，現在，検討準備中である。予定していた菌対数測定器を購入しない場合は, デジタル PCR を行うに必要な消耗品類（酵素・専用オイル・プレート等）の購入に充てる。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Molecular characterization of Staphylococcus argenteus in Myanmar: identification of novel genotypes/clusters in staphylocoagulase, protein A, alpha-haemolysin and other virulence factors2019
Author(s)
Aung MS, San T, San N,Oo WM,May Ko PM, Thet KT, Urushibara N, Kawaguchiya M, Sum A, Kobayashi N
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Journal Title
J Med Microbiol
Volume: 68
Pages: 95-104
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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