2019 Fiscal Year Research-status Report
簡便かつ安価で安全に行えるPapainを用いた新しいプランクトン検査法
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18K10132
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
柿崎 英二 宮崎大学, 医学部, 准教授 (70284833)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
園田 愛 宮崎大学, 医学部, 助手 (10762122)
新川 慶明 宮崎大学, 医学部, 助教 (40625836)
湯川 修弘 宮崎大学, 医学部, 教授 (30240154)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 法医学 / 溺死の診断 / プランクトン検査 / Papain / タンパク質分解酵素 / 珪藻 / Proteinase K |
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| Outline of Annual Research Achievements |
溺死は診断することの難しい死因の１つである。警察庁の統計でも，犯罪を見逃した事案の中で溺死に関連するものが多い。現在，溺死診断の一助としてプランクトン検査（壊機法）が広く利用されているが，一方で様々な問題も抱えている。即ち，多くの時間と労力を要するだけでなく，加熱沸騰させた強酸を用いるため，安全面（化学熱傷，酸性ガスの吸引）や設備面（遠心機及び周辺機器への金属腐食，ドラフトチャンバーの設置・維持管理）の問題もある。そこで，我々は危険な強酸を用いずに安全かつ簡便・迅速に行える新しいプランクトン検査法の開発に取り組んだ。組織や細胞の溶解にはProteinase K（微生物由来タンパク質分解酵素）が広く利用されている．法医学領域でもこれを応用した報告が比較的早く（1994年）からあるものの，高価であることや溶解能が十分でないことから広く実務利用されてこなかった．そこで，我々は安価に入手可能なPapain（植物由来タンパク質分解酵素）に着目し至適条件を検討した結果，組織（ブタの肝臓，腎臓，肺）を迅速かつ強力に溶解できることを明らかにした．また，タンパク質分解酵素（Proteinase K，Papain）と界面活性剤（SDS）の同時使用は酵素活性を顕著に低下させることも分かった．さらに，使用する試薬にも珪藻が含まれていること（特にSDS）が示され，試薬類のフィルター濾過や陰性対照をおくことの重要性が示された．一方，脂質の分解を目的としてリパーゼ等の添加も検討したが，分解能の明らかな向上はみられず，操作ステップや経費が増えるため実務検査として適さなかった。さらに組織の微生物分解も検討したが，充分な効果は得られないと判断した。また，珪藻は化学的には非常に安定であるものの，物理的な力に対しては壊れやすい種も多く，酵素溶解液の攪拌時やプレパラート封入時に注意を要することも示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究成果から，安価なPapain（植物由来タンパク質分解酵素）を用いることにより最も少ない労力で強力にヒト組織（肺，腎臓，肝臓）を溶解できる諸条件を決定できた。この方法によってこれまでの問題点（上記概要の項で示した）を飛躍的に改善でき，将来実務の現場においても迅速かつ簡便で安全なプランクトン検査が可能になると期待できる。最終年度の実務応用に向けて十分な進展がありその準備は整ったと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後，実際の水中死体に対して，本法を実施しヒト組織への効果や実務利用への有効性を明らかにする．但し，臓器の種類（肺，腎臓，肝臓）や重量（1 g，10 g），さらに臓器の性質や状態（水腫状，うっ血状，貧血状，腐敗の程度，加齢性変化等）に合わせて，酵素の使用量や反応時間の延長など，その都度各事例ごとに微調整を行い対処していくことも必要となるものと考えている．また，高度な腐乱死体についてはPapainの溶解能への影響が予想されるためその実用性も検証していく。
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| Causes of Carryover |
研究は順調に進行しているため，予備実験や再実験等の予算を節約することができてこれを次年度使用に充てることができた。本研究では写真による検査方法・結果の詳細な情報提示を行っていくために顕微鏡写真を含めて膨大な画像を扱う必要があり，このような処理を負担なく行えるようPCの更新を予定している。また現在使用している機種は今後最新のOSに対応できなくなる恐れがあり，セキュリティーの点からも次年度予算にこれを充てて対処・改善していく計画である。
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Research Products
(7 results)
