2018 Fiscal Year Research-status Report
損傷微量DNAにおけるSTR解析に最適な前処理方法の開発
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18K10136
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
町田 光世 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (60468692)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 全ゲノ増幅法 / DNA損傷 / STR解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
法医学における個人識別では主にshort tandem repeat（STR）解析が用いられているが、環境への曝露などでDNAが損傷した場合にSTR解析は困難となることがある。そこで、ゲノムDNAをランダムに増幅する全ゲノム増幅法に着目し、全ゲノム増幅法が損傷DNAを用いたSTR解析に対して有効かどうかを検討した。
実験協力者から採取した唾液を濾紙に染み込ませ、唾液が付着した濾紙を3、7、14日、1ヶ月間UVA（365nm）で照射した後、QIAamp DNA mini kit（QIAGEN）によりDNAを抽出した。抽出したDNAの5 ngと0.5 ngについて、PCR反応に基づいたmodified improved primer extension preamplification（mIPEP）法により全ゲノム増幅を行い、増幅前後のDNAをAmpFlSTR Identifiler PCR amplification kit（Thermo Fisher Scientific）でSTR解析を行った。本学遺伝子解析研究に関する倫理審査委員会の承認を得て実施した。
UVA照射3日では、DNA5 ngと0.5 ngを用いて全ゲノム増幅した時と全ゲノム増幅を行わない時のSTR検出数に差は認められなかった。UVA照射7、14日、1ヶ月では、DNA5 ngを用いて全ゲノム増幅した時のSTR検出数はDNA0.5 ngを用いて全ゲノム増幅した時や全ゲノム増幅を行わない時のSTR検出数よりも有意に多かったが（p<0.05）、DNA0.5 ngを用いて全ゲノム増幅した時と全ゲノム増幅を行わない時のSTR検出数に差は認められなかった。従って、損傷したDNA試料では5 ngのDNAを用いて全ゲノム増幅を行うことでSTR解析が改善されることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
4名の試料提供者から唾液を採取し、濾紙に染み込ませた状態とスライドグラス上に滴下した状態の2条件で試料を作成し、犯行現場における遺留物の擬似試料とした。作成した唾液試料は異なる温度（4℃、室温、37℃）で保存、紫外線照射、屋外環境への曝露の3条件で処理を行い、DNAの損傷状態を調査した。全試料に対してSTR解析を行い、損傷処理日数に伴うアリルピーク高、正確に検出されたSTR数やヘテロ接合体ピーク高比率等の変化を分析した。処理期間は、未処理（0日）を含めて、3日、7日、14日、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年間の8群で、現時点では6ヶ月処理試料のSTR解析まで終了している。損傷試料のSTR解析成功率は、DNA損傷の種類や唾液が付着した素材によって、同じ処理日数でも大きく異なることが示された。また、損傷試料に効果があると報告されている全ゲノム増幅法 modified improved primer extension preamplification（mIPEP）法に着目し、使用するDNA量や損傷処理日数がmIPEP法にどのような影響を与えているかを調査した。紫外線照射試料において、mIPEP法に用いるDNA量を5 ng（実務試料としては豊富なDNA量）、0.5 ng（通常のSTR解析に用いるDNA量）、0.05 ng（微量DNA）の3条件でSTR解析を行った結果、損傷処理日数が長いほど、mIPEPを行った試料はmIPEPを行わない試料よりもSTR検出数が多かった。従って、高度に損傷したDNA試料では全ゲノム増幅が有効であることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、様々な条件でDNA損傷させた試料を用いて、異なる増幅メカニズムであるmodified improved primer extension preamplification（mIPEP）とmultiple displacement amplification（MDA）法により全ゲノム増幅を行う。今年度は、DNA損傷試料における全ゲノム増幅法の有効性を明らかにするために、紫外線照射したDNA5 ng、0.5 ng、0.05 ng を用いてmIPEP法で検討したが、次年度は様々な条件下で損傷させた微量DNAを用いて、2種の主要な全ゲノム増幅法の有効性を検討する。特に0.05 ngの微量損傷DNAを用いた時、(1) 全ゲノム増幅法によって検出されるSTR座位に違いはあるのか、(2) 損傷を受けて検出困難となったSTR座位が、全ゲノム増幅によって検出されるようになるのか、について調査する。(1)では、今年度に準備した異なる温度で保存した試料や野外環境への曝露試料に対してSTR解析を行い、紫外線照射に限らず様々な損傷状態の試料について、全ゲノム増幅法が有効かどうかを検討する。(2)については、DNA損傷度をリアルタイムPCRにより算出し、全ゲノム増幅の効果がみられるDNA損傷度を示すことによって、どのようなDNA損傷度の時に全ゲノム増幅を行うとSTR解析の改善がみられるかを推定する。以上、次年度は様々な状況で損傷した微量DNAのSTR解析に全ゲノム増幅が有効かを、異なる手法で比較検討する。
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Research Products
(4 results)
