2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K10137
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
副島 美貴子 久留米大学, 医学部, 准教授 (80279140)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神田 芳郎 久留米大学, 医学部, 教授 (90231307)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ABO式血液型 / 分子進化 / 転写調節 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ABO式血液型抗原は、ヒトでは赤血球のみならずさまざまな組織に発現している。しかしながら、哺乳類での組織発現を比較すると赤血球膜表面にABO抗原が存在する生物種はヒトと類人猿に限られ、ヒトに近い種ほど発現する組織が多い。同抗原が赤血球で発現するようになったのは進化の過程ではかなり最近のイベントであると考えられ、ヒトと類人猿の共通の祖先と他の霊長類のそれとの種分化の後に起こった遺伝情報の変化により獲得したものと予想される。本研究では、なぜヒトと類人猿でABO抗原が赤血球で発現するようになったのか、その分子メカニズムを明らかにするために、赤血球でのABO抗原の発現をコントロールしているH酵素遺伝子であるFUT1の転写調節機構に注目し、転写調節機構を解明する。さらに、組織分布が異なる動物種間の比較を利用することで、培養細胞を用いゲノム編集技術を用いヒトのFUT1に特徴的な配列から候補領域をノックダウンし、転写産物さらに遺伝子産物であるH酵素の産物の発現の変化を確認する。
当該年度では、データベースを用いて霊長類のFUT1の相同領域の種間相違について調べ、以前予想した3つのプロモーターのうち、上流から2つ目のプロモーター内に存在するリピート配列、ミニサテライト、Alu配列、Long Terminal Repeatが特徴的なターゲットであることを確認した。そこで、赤血球系の様々な分化度の細胞株を対象とし、エレクトロポレーション法を用いゲノム編集により2つ目のプロモーター内のAlu配列のノックダウン実験をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Cas9タンパク質とガイドRNAの複合体の直接導入法として、リポフェクション法よりも導入効率が高いとされているエレクトロポレーションを採用し、数種のガイドRNAを用いて実験をおこなったが、現在までにターゲットがノックアウトされたクローンを単離できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
効率を上げるための方策として、①細胞への導入前にガイドRNAの有効性をin vitroで確認する、②コラーゲン等のコーティングディッシュを用いる、を計画している。これらの方法でもクローンの樹立が困難な細胞については、レンチウイルスを用いたゲノム編集をおこなう、あるいは経験者に相談し遂行する予定である。
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| Causes of Carryover |
上記のようにノックアウトクローンが樹立出来なかったために遅延が生じたものである。次年度でも引き続き遺伝子導入、クローニングをおこなう必要があり、さらに転写産物の解析やFUT1の遺伝子産物であるH酵素の産物の解析を行うための費用に充てる予定である。
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