筋肥大時に骨格筋の成長ホルモンに対する反応性は低下するのか

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K10814
• Research Institution: Nagoya Institute of Technology
• Principal Investigator: 花井 淑晃 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50360730)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 成長ホルモン / 成長ホルモン受容体 / 筋肥大 / IGF-1

Outline of Annual Research Achievements

我々の研究室では、以前より、骨格筋に対するGHの成長促進作用について、特に、骨格筋におけるGH受容体の発現調節の面から検討を行っている。これまで、ラット下腿の筋ではGH受容体の発現は筋により異なり、遅筋であるヒラメ筋では低く、足底筋、長指伸筋等では高いことや、これらの筋によるGH受容体発現レベルの違いが生後成長によって生じること、また、GH投与時の反応性についても、GH受容体の発現レベルにより違いが生じ、GH受容体発現レベルの低いヒラメ筋ではGH投与時のIGF-1の発現誘導が低いことなどを学会発表等で明らかにしてきた。
本課題における検討では、骨格筋肥大を処置した実験動物（ラット）の骨格筋では、GH受容体の発現レベルが肥大初期（2から4日）に低下することが明らかとなったことから、1.肥大筋でのGH受容体の発現レベルの低下のメカニズムを探ること、2.GH受容体の発現レベルの低下によって、実際にGH投与時のGHに対する反応性が低下しているか否かを明らかにすること、の2点について検討を行うことを主目的としている。
1.のGH受容体の発現レベルの低下のメカニズムついては、肥大筋における、筋の高強度の収縮活動そのものによって調節される影響を考え、電気刺激による強収縮後の変化について検討を行ったところ、実際に筋肥大が生じる高強度の筋収縮活動の6時間後の時点では、GH受容体の発現に変化は認められなかった。ゆえに、GH受容体の発現の低下は筋の収縮活動自体によりもたらされる可能性は低いことが明らかとなった。
2.のGH投与時の肥大筋におけるIGF-1反応が低下するか否かについては昨年度は動物実験を実施して確認することができなかったため、今年度に繰り越した。すでに、実験を実施する準備は整っているため、実験を実施して確認する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

今年度の本研究課題のこれまでの進捗状況については「遅れている」との自己点検評価とした。
「遅れている」とした理由については、当初予定であった、骨格筋肥大処置を施したラットの下肢骨格筋において、筋肥大の初期に観察されるGH受容体の発現の低下が、骨格筋のGHに対する反応性に影響するか否かを確認する実験を実施することができなかったためである。
昨今のコロナ禍の状況下で研究室の実験活動や研究活動、動物実験のトレーニング等、対面実施の難しさから、実験を実施するためのスキルの獲得が難しく、また、試薬の手配の遅れもともなって、動物実験を実際に行うことが難しく、来年度への繰越となった。今年度についてはすでに実験に必要な試薬や機器、消耗品の手配は完了しており、あとは実際に実験動物を購入して実験を実施し、分析を行うまでとなっている。動物の購入は6月までには行い、7月中には解析を終了したいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進方策としては、すでに、実験に必要な分析機器、消耗品、試薬等の準備は整っているので、実際に実験動物を購入し、実験を実施してサンプルを分析するまでとなっている。
実験を実施するための予算については、昨年度の分をほぼ全額繰り越して使用できることから十分な額となっている。
文献研究によって、筋肥大が生じている骨格筋におけるGH受容体の発現量の低下によって、GHシグナルが低下していることを確認するには、その後の時間オーダー（6時間がピーク）で生じるIGF-1の遺伝子発現の増加の程度に影響するか否かについてのみではなく、より早い段階（GH投与簿30分程度）での、肥大筋における、シグナル蛋白の活性化の解析が必要であるとの判断に至った。GH刺激により活性化され、IGF-1の発現を惹起する細胞内シグナルはJAK-STAT経路のSTAT5bのリン酸化により評価できる。STAT5bはGH刺激によってリン酸化して2量体を形成して核内に移行し、IGF-1遺伝子の上流に結合してIGF-1の発現を増加させる転写因子として作用する。ゆえに、実験モデルにGH投与後、30分の時点のサンプルを追加し、STAT5bタンパクのリン酸化抗体を用いたwestern blot解析によって、STAT5bのリン酸化を評価し、GH受容体発現の低下との関連性について検討を行う予定である。また、これまでタンパクレベルの解析ではまだ、GH受容体の発現レベルが筋肥大によって実際に低下が生じるか否かは明らかにできていない。これはGH受容体のwestern blotで使用できる抗体が検出感度の良いものが準備できなかったことによるもので、この点については文献研究をすすめて、実際の組織で感度の良い定量に成功している抗体を調べ、動物実験で使用した予算のあまりで抗体をいくつか購入して分析を実施したいと考えている。

Causes of Carryover

昨年度はコロナ禍による研究活動の諸々の影響のために動物実験を実施することができず、実験動物の実施およびそのサンプルの解析、データ発表のための学会旅費、論文作成のための雑費等、すべて支出することなく、繰越となった。
繰越となった予算の使用計画としては、昨年度実施する予定であった動物実験の実施、およびサンプルの分析と成果の公表に支出する予定である。動物実験は、下垂体摘除動物を購入して、片足に代償性肥大処置をおこない、GHを外因性に投与して30分後、および6時間後にサンプリングを行うモデルで、得られた組織サンプルにおける遺伝子発現の変化をqRT-PCR法により分析を行う。また、細胞内シグナルタンパクの分析にはリン酸化タンパク抗体を用いたwestern blotによって行う。この実験に関連する消耗品と試薬、動物の購入費用として支出する予定である。
また、得られた成果については、国内学会、あるいは国際学会で発表を行いこれまでに得られているデータとまとめて投稿論文としてまとめて国際紙に投稿する予定なので、これらに対して支出する予定である。