2020 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of myokine release in response to plasma membrane disruption
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18K10822
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
三宅 克也 国際医療福祉大学, 成田キャンパス基礎医学研究センター, 教授 (30219745)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 細胞膜損傷 / 細胞膜修復 / カルシウムイメージング / 細胞外小胞 / マイオカイン / 二光子レーザー / 膜融合 / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜損傷修復は生理的な条件下で様々な細胞で起こっている。我々は、高感度GaAsP搭載型多光子レーザー顕微鏡によるLIVEイメージングを行い、膜修復メカニズムをリアルタイムの分子動向で明らかにしてきた。本研究では、最新型の多光子高速スキャンレーザー顕微鏡を用い、スポーツによる筋線維膜損傷修復とマイオカインの分泌過程を顕微鏡下に再現し、筋線維からのマイオカインの多様な分泌現象を、超高速・超解像レベルで明らかにすることを目的としている。現在のところ、膜融合阻害剤とAryscanを用い、細胞膜損傷直後に生じる修復膜がどこから供給されるのか詳しく追跡している。培養細胞（BS-C-1, NIH3T3, C2C12, MKN45, MKN28, BRMEなど）を用い、シリンジローディングなど様々な損傷法によって培養細胞の細胞膜を損傷し、細胞外小胞形成過程を形態学的に観察した。また、金コロイド(10nm)処理を行ったカーボン支持膜付き金グリッドに培養細胞を滴下培養し、金グリッドをディッシュから引き剥がした直後にプランジャー（Leica）によって液体エタンへ凍結固定を行ない、クライオ電子顕微鏡（CRYO-ARM TM300, JEMZ300FSC, JOEL)にてトモグラフィー画像（厚さ12nm、日本電子提供）を得て形態学的に観察を行なった。その結果、LIVEイメージングによって、二光子レーザーによる損傷直後にナノサイズの細胞外小胞の離出が数多く観察された。クライオ電子顕微鏡観察では、損傷細胞から発芽様に突出または離出したエクトゾームが観察され、その内部にリボゾームや、様々なタンパク質と思われる構造物が高解像度で観察された。さらに Cal520によるカルシウムイメージングを用い、細胞膜損傷による細胞外シグナル伝達をとらえることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養細胞とレーザー顕微鏡を使った実験は進んでいるが、多くの予想外の実験結果も出ている。とくに阻害剤による膜修復時のダイナミックな膜動態を観察できた。これらを解析するため、生化学的な実験とCa2+イメージング用いた新しいアプローチを試みているが、新型コロナウイルス感染拡大のため共同実験が進んでいない。
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| Strategy for Future Research Activity |
Aryscanと膜融合阻害剤をもちい、細胞膜修復時に供給される膜動態を解明する。細胞質から分泌されるサイトカイン候補、FGFファミリー、炎症反応に関わるインターロイキンについてGFPの作製を行い、細胞膜損傷修復時におけるそれらの分泌動態を高速レーザー顕微鏡によって観察を行う。シリンジローディングなどの損傷方法を用い、損傷時に分泌されるサイトカインをウエスタンブロティングによって検出する。遺伝子導入を行ったマウスを用い、生きた骨格筋線維内の膜供給ライブイメージングを行う。また動物走行実験を行い、運動による骨格筋からのサイトカイン（マイオカイン）の測定を行う。
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| Causes of Carryover |
新型コロナまん延のため共同研究実験ができなかった。ワクチンによる感染防止後、再開した国際共同実験を行うための実験試薬、渡航費、滞在費に充填する計画である。
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Research Products
(19 results)
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[Journal Article] AMPK Complex Activation Promotes Sarcolemmal Repair in Dysferlinopathy2020
Author(s)
Ono Hiroya、Suzuki Naoki、Kanno Shin-ichiro、Kawahara Genri、Izumi Rumiko、Takahashi Toshiaki、Kitajima Yasuo、Osana Shion、Nakamura Naoko、Akiyama Tetsuya、Ikeda Kensuke、Shijo Tomomi、Mitsuzawa Shio、Nagatomi Ryoichi、Araki Nobukazu、Yasui Akira、Warita Hitoshi、Hayashi Yukiko K.、Miyake Katsuya、Aoki Masashi
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Journal Title
Molecular Therapy
Volume: 28
Pages: 1133～1153
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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