2020 Fiscal Year Research-status Report

散発性アルツハイマー病解明に向けた脳におけるアポE含有リポタンパク代謝経路の解析

Research Project

Project/Area Number	18K10995
Research Institution	Ehime University
Principal Investigator	藤野貴広愛媛大学, 学術支援センター, 准教授 (40292312)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	アルツハイマー / アポE
Outline of Annual Research Achievements	アポＥ4は散発性アルツハイマー病の主要な危険因子であるが、アルツハイマー病発症における役割についてはほとんど明らかにされていない。脳内におけるアポEはコレステロールなどの脂質と複合体を形成し、いわゆるアポE含有リポタンパク（アポE-nHDL）として存在し、アポEを認識する受容体を介して神経細胞に取り込まれることでグリア細胞からコレステロールの供給を受けていると考えられている。我々は、脳内に近い形の糖鎖修飾を受けたヒト・アポE及び糖鎖修飾を受けないアポE変異体の発現系を確立し、これらを大量に得る事に成功した。さらに、In vitroにおいてこれらアポEをアポE-nHDLへと効率よく変換する系を確立し、純粋なアポE-nHDLを比較的多量に得ることができた。精製アポE-nHDLを様々な神経損傷モデルのマウス脳室内に注入し、その動態を解析したが、神経細胞へのアポE-nHDLの取込みは観察されなかった。神経細胞は定常状態ではほとんどアポE-nHDLを取り込まないが、神経細胞の増殖、神経突起の進展、損傷修復等の時には盛んにアポE-nHDLとしてコレステロールを要求することが知られている。また、脳虚血・再灌流モデルのスナネズミ海馬では、損傷を受けた海馬神経細胞に多量のアポEが沈着することが報告されている。しかしこれまでの結果は、in vivoにおけるアポE-nHDL脳室内への注入による機能解析は極めて困難で、ノックインマウスの作成等による長期的な観察でなければ困難であることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason アルツハイマー病患者の病理組織像で観察される神経原繊維変化の基本骨格は高度にリン酸化されたタウ蛋白である。アルツハイマー病においては何らかの機構によって、タウ蛋白のリン酸化の亢進又は脱リン酸化の減少が起こることによって神経原繊維変化が引き起こされると考えられている。そこでアポE4-nHDLを取り込ませた神経細胞のタウ蛋白のリン酸化状態を特異抗体を用いて観察すると同時に、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子(アミロイドβ、β及びγセクレターゼなど)との機能的な関連を検討する目的で、家族性タウオパチー変異（hTau P301L）をもつタウ蛋白発現ベクターを構築した。さらに、神経由来の培養細胞（Neuro2aやSH-SY5Y細胞）だけでなく、リポタンパク受容体欠損マウス由来の初代培養細胞へも応用可能なように、レンチウイルスを介した家族性タウオパチー変異（hTau P301L）タウ蛋白の発現系を確立した。しかし昨年度は、新型コロナウイルスの感染拡大を受けて、年度当初に緊急事態宣言が全国に発出され、研究活動の大幅な縮小が大学より指示された。また緊急事態宣言解除後も、感染拡大の第2波、第3波があったことや担当授業の遠隔化対応に大幅な時間が取られたため、殆ど研究を進展させることが出来なかった。
Strategy for Future Research Activity	線維化タウ蛋白のシードと共に家族性タウオパチー変異（hTau P301L）をもつタウ蛋白発現ベクターを神経由来の培養細胞に導入することで、タウ凝集体を細胞内に形成することが知られている。そこで今年度は、レンチウイルスによる家族性タウオパチー変異タウ蛋白を線維化タウ蛋白のシードと共に神経由来の培養細胞（Neuro2aやSH-SY5Y細胞）に発現させ、細胞内におけるタウ蛋白のリン酸化状態を観察すると共に、アポE及びアポE-nHDLを同時に取り込ませた際のタウ蛋白の変化（線維化やリン酸化状態）を観察したいと考えている。もし、アポE及びアポE-nHDLを取り込ませた細胞において、タウ蛋白への線維化やリン酸化に変化が見られた場合、リポタンパク受容体欠損マウス由来の初代培養細胞を用いて、アポEの取り込みによるタウ蛋白の変化をを確認する。今年度は今後の新型コロナウイルス感染の拡大状況次第で研究がどこまで実施できるか不透明であるが、少なくとも上述の部分までは最低でも実施したいと考えている。
Causes of Carryover	新型コロナウイルスの感染拡大を受けて、年度当初に緊急事態宣言が全国に発出され、研究活動の大幅な縮小が大学より指示された。また緊急事態宣言解除後も、感染拡大の第2波、第3波があったことや担当授業の遠隔化対応に大幅な時間が取られたため、殆ど研究を進展させることが出来なかったため。