2019 Fiscal Year Research-status Report
Effects of food materials on the interaction among reactive sulfur species, nitrogen species, and oxygen species in the large intestine.
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18K11015
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
輿石 一郎 群馬大学, 大学院保健学研究科, 教授 (20170235)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 活性硫黄分子種 / 活性酸素種 / 活性窒素種 / サルフェン硫黄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、生体組織の恒常性と腸内細菌叢との関連がクローズアップされている。我々は、特に、血管系の恒常性維持への腸内細菌叢の寄与について検討を試みている。本研究では、標的細胞として血管内皮細胞、血小板および好中球を、中心となる作用物質として、ガス状メディエーターである硫化水素から産生される活性硫黄分子種（RSS）を取り上げた。
主に大腸では、硫酸イオンを電子受容体として硫酸還元菌により硫化水素が産生される。硫化水素は、大腸粘膜上皮細胞で産生される活性酸素種や活性窒素種により1電子酸化を受け、硫黄中心ラジカルとなる。硫黄中心ラジカル種はラジカル―ラジカル付加反応により多硫化水素を形成する。多硫化水素はスルフヒドリル基にサルフェン硫黄を転移し、パースルフィドを形成する。この反応が大腸粘膜上皮細胞内で起きた場合、このパースルフィドが血管腔へ排出され血管内皮細胞、血小板、好中球に作用すると考えられる。
令和元年度は、培養細胞を用い、培地中に多硫化水素を添加することで細胞中にグルタチオンパースルフィドが産生されるか否かについて検討を試みた。本研究では、HPLCを用いたグルタチオンパースルフィドの簡易型・高感度測定系を確立し、多硫化水素で処理した細胞への応用を試みた。その結果、多硫化水素処理により、細胞内に有意にグルタチオンパースルフィド濃度が増加することが確認された。本研究成果は、消化管内で産生される多硫化水素の血管内皮細胞、血小板、好中球への送達経路として、粘膜上皮細胞を介したグルタチオンパースルフィド（またはシステインパースルフィド）を送達形とする送達経路の可能性を示唆するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グルタチオンパースルフィドの測定法として、東北大学の赤池孝章らは、アルキル化剤として蛍光アルキル化剤であるBromobimaneを用い、アルキル化体をLC-MS/MSで測定する系を報告している。赤池らはこの系を用い、細胞内には構成的にグルタチオンパースルフィドが存在し、脳神経細胞内には数百μMレベルで存在すると報告している。しかしながら、近年、Bromobimaneを用いた方法は、タンパク質内に存在するサルフェン硫黄によるアーティファクトを測定していることが明らかとなった。これは、Bromobimaneのスルフヒドリル基のアルキル化反応速度の遅さによるものと考えられる。すなわち、アルキル化剤でパースルフィドを安定化するためには、その後に付随するスルフヒドリル基との反応を止めなくてはならない。この目的に適うアルキル化剤として、ヨードアセタミドが挙げられる。ヨードアセタミドはグルタチオンのスルフヒドリル基を37℃で1分以内にアルキル化することが可能である。そこで、グルタチオンパースルフィドとの反応産物であるアセタミド化グルタチオンパースルフィド（G-SS-AA）をアルキル化条件下オルトフタルアルデヒドを用いた蛍光ポストカラム誘導体化HPLCで高感度検出する方法を開発した。特徴として、この測定系では、アセタミド化グルタチオン（G-S-AA）は検出されないことから、過剰に存在するグルタチオンの影響は受けない。本測定系を、多硫化水素で処理されたHT1080細胞に応用したところ、細胞内にグルタチオンパースルフィドの産生が確認された（論文投稿準備中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究の結果、大腸内腔において生成される硫化水素、一酸化窒素およびスーパーオキシドアニオンラジカルの相互作用により生成される安定型反応産物は多硫化水素であることが明らかとなった。多硫化水素は、粘膜上皮細胞に取り込まれ、グルタチオンにサルフェン硫黄を転移し、グルタチオンパースルフィドを形成し、Basolateral sideに放出すると考えられた。令和2年度は、特に、血管内皮細胞によるグルタチオンパースルフィドあるいはシステインパースルフィドの取り込みと、血管内皮細胞の生理機能への影響を明らかにする。特に、脂質過酸化物と鉄イオンによる細胞障害への影響について検討する。この研究により、虚血再灌流障害の初期における血管内皮細胞層の破綻の機序を明らかにすることが可能となり、食を介した予防法のエビデンスを示すことが可能と考える。
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| Causes of Carryover |
令和元年度は、平成30年度に見出した「生体内への活性硫黄分子種の取り込み経路としての植物性食品（野菜類）の重要性」をもとに、活性硫黄分子種を含まないマウス用餌を調整し、マウスに給餌し、肝臓および脳組織中活性硫黄分子種含量の変動を明らかにすることで、組織と餌中活性硫黄分子種の関連を明らかにした。その結果、当初予定していた、細胞培養実験の仕様を大腸粘膜上皮細胞を用いたモデル実験系を追加することが必要となり、次年度に繰り越すこととなった。令和２年度は、平成30年度および令和元年度の成果に基づき、細胞培養ならびに実権動物を用いた応用研究を実施する。
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