2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K11036
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| Research Institution | Hiroshima International University |
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Principal Investigator |
堀 隆光 広島国際大学, 薬学部, 教授 (00199522)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | AGEｓ / 血管内皮細胞 / グリセルアルデヒド / 血管透過性 / RasGRP2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生活習慣病の1つである糖尿病は、発症しても自覚症状がほとんどないため、合併症の重症化によって死に至る危険性も大きい。糖尿病の合併症に共通する重大なイベントとして血管障害があり、その起因物質の1つに終末糖化産物（advanced glycation end-products; AGEs）が挙げられる。AGEsによる血管障害は、血管内皮細胞死や炎症反応、血栓形成、粥腫内での血管新生など様々な過程を経て引き起こされるため、関与する細胞は血管内皮細胞、マクロファージ、壁細胞、血小板など多岐にわたる。血管内皮細胞の研究については、様々な面から解析が行われ、酸化ストレスの惹起から始まる障害のメカニズムが解明されつつある。一方で、その治療薬やAGEsの形成阻害剤などは未だ開発されておらず根本的な解決に至っていない。本研究においては、重症化予防の観点からAGEsによる血管障害において、血管内皮細胞におけるras guanyl nucleotide releasing protein 2（RasGRP2）の防御因子としての機能を追求することを目的としている。
大血管障害や細小血管障害を最大限に模倣し、評価できるように、大血管由来及び微小血管由来（HUVEC：大血管由来、HDMEC：微小血管由来）の不死化血管内皮細胞を用いて、RasGRP2安定過剰発現株を樹立した。また、樹立した不死化HUVECのRasGRP2安定過剰発現株およびそのMock株にグリセルアルデヒド由来AGEs（Glycer-AGEs）を添加したところ、RasGRP2安定過剰発現株でGlycer-AGEsによる血管透過性の亢進が有意に抑えられた。
今後は、Glycer-AGEsが引き起こす生理的変化に対して、RasGRP2がどのように防御因子として働くか詳細に検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度では、不死化HDMECを用いたRasGRP2安定過剰発現株の作製の一環として、限外希釈法によるシングルセルクローニングを行い、RasGRP2安定過剰発現株およびそのMock株を樹立することに成功した。また、既に樹立済みである不死化HUVECのRasGRP2安定過剰発現株におけるGlycer-AGEs添加による影響を解析した。その結果、蛍光標識デキストランを用いた血管透過性解析において、RasGRP2安定過剰発現株はGlycer-AGEsが引き起こす血管透過性の亢進をMock株と比較して有意に抑えた。また、Mock株ではreactive oxygen species (ROS)スカベンジャーであるN-acetyl L-cysteine (NAC)の前処理によってGlycer-AGEsの透過性亢進が一部抑制されたが、RasGRP2安定過剰発現株のレベルまでは抑制されなかった。さらに、RasGRP2安定過剰発現株はNAC前処理によってGlycer-AGEsの透過性亢進をさらに抑制することはなかった。これらのことから、RasGRP2安定過剰発現株はROS産生を抑えることによって、Glycer-AGEsが引き起こす透過性亢進の一部を抑えていることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
Glycer-AGEsが引き起こす血管透過性亢進のメカニズムは良く知られていない。また、RasGRP2による抑制メカニズムも詳しく検討されていないため、これらのシグナルの詳細な解析を行う予定である。具体的には、RasGRP2のターゲットとして良く知られているsmall GTPaseのひとつであるRap1シグナルを介した抑制メカニズムの検討、およびその他のターゲットsmall GTPaseの探索や、阻害剤を用いたシグナル経路の特定を中心に検討する。
また、新たに樹立した不死化HDMECのRasGRP2安定過剰発現株に対しても同様の解析を行い、Glycer-AGEsが引き起こす影響や防御因子としてのRasGRP2の影響を検討したい。
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| Causes of Carryover |
製造業者に発注した製品が、クオリティーチェックを通らず納品が30年度までに間に合わなかったため、31年度に改めて発注する予定である。
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