2018 Fiscal Year Research-status Report
Indigestible carbohydrates which contribute to increasing true large bowel mucus and its a decisive factor.
| Project/Area Number |
18K11048
|
|---|
| Research Institution | Nayoro City University |
|---|
Principal Investigator |
田邊 宏基 名寄市立大学, 保健福祉学部, 講師 (60573920)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ビートファイバー / ムチン / 腸内細菌 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々は発酵性を持つ難消化性糖質のうちビートファイバーのみが大腸において粘液の主成分であるムチンの合成を促進することを発見した。その他の発酵性を持つ難消化性糖質は大腸内pHを下げることでムチン分解酵素の活性を抑制し、見かけ上のムチン量を増加させていた。腸内細菌の適応によってpHは元の状態に戻るため、通常の難消化性糖質によるムチン量上昇は一過性である。恒常的なムチン量の増加には合成の促進が必須である。
本研究の目的は、「ビートファイバーを利用する腸内細菌から分泌される物質が大腸の粘液合成を促進する」という仮説を証明し、大腸の防御機能増強を意図してこの物質を積極的に制御するような食品を創出することである。
目的を達成するために、まずSDラットに5％ビートファイバー飼料を摂取させ、大腸内ムチン量の増加を確認後に盲腸内容物を回収する。予備検討で行った次世代シーケンサで増加していた菌の選択培地に盲腸内容物を添加し、必要な菌株を得る。次いで、先に回収した盲腸内容物を分画し、どの画分に大腸粘液合成促進作用が認められるか解析する。並行して、複数の抗生物質で腸内細菌を排除したSDラットに先の実験で得られた菌株を移植し、大腸粘液合成促進作用を検証する。さらに、ビートファイバー内の難消化性糖質を分画してSDラットに与え、同様の効果が認められる難消化性糖質を選出する。現在は5％ビートファイバー飼料を摂取させたラットから盲腸内容物を回収し、菌株を選択しているところである。既に盲腸内容物の有機溶媒による分画は完了している。今後選択された菌株または盲腸内容物画分とヒト結腸上皮細胞株を共培養し、ムチン合成酵素発現量が上昇する菌および物質の特定に挑む。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね順調に進行している。具体的には、6週齢のSD系雄性ラットを用い、対照食または5%ビートファイバー添加食で14日間飼育した。飲水は水道水を自由飲水させた。この間、飼料摂取量、体重、糞便量、糞中ムチン量の推移を記録した。最終日に安楽死させ、盲腸を摘出した。盲腸組織から盲腸壁の組織学的観察と上皮組織のムチン合成酵素遺伝子発現量を解析した。盲腸内容物は2つに分け、1方はCO2雰囲気下で希釈液を用いて1/10に希釈し、30 xgで2分間遠心分離した。上層に終濃度10％となるようにグリセリンを加え、総菌叢サンプルとして-80°Cで保存した。他方は総細菌数をqPCR法で測定し、細菌叢構成パタンをメタ16S rRNA遺伝子解析により明らかにした。現在、予備検討で行った次世代シーケンサで増加していた菌の選択培地に盲腸内容物を添加し、必要な菌株を得る作業を継続中である。並行して、先に回収した盲腸内容物を等量の蒸留水で希釈し、37℃で1時間インキュベートした。これに内容物と等量のヘキサンを加え37℃で1時間インキュベートした。これを3度繰り返し、ヘキサン抽出画分を得た。続いて水層に内容物と等量の酢酸エチルを加え37℃で1時間インキュベートした。これを3度繰り返し、酢酸エチル抽出画分を得た。続いて水層に内容物と等量のブタノールを加え37℃で1時間インキュベートした。これを3度繰り返し、ブタノール抽出画分を得た。残りの水層は3000 xgで30分間遠心分離し、水抽出画分と残渣分けた。有機溶媒の極性差を利用した分画は完了した。現在、薄層クロマトグラフィーの2次元展開によりさらなる物質の単離作業を行っている。また、この有機溶媒抽出画分とヒト結腸上皮細胞株を共培養し、ムチン合成酵素発現量が上昇する画分の特定作業を行っている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在進行中の実験は5％ビートファイバー飼料を摂取させたラットから盲腸内容物を回収し、選択培地を用いた逆培養によって菌株を選択しているものと、盲腸内容物の有機溶媒抽出画分を薄層クロマトグラフィーの2次元展開によって更に分画しているものである。今年度はこれらの実験の完了とともに2つの実験を予定している。薄層クロマトグラフィーの2次元展開によって細分化された盲腸内容物画分をDMSOで適宜生理的濃度まで希釈し、ヒト結腸上皮細胞株HCoEpiCに暴露させる。5％CO2下37℃で6、12および、24時間培養し、コラゲナーゼ処理を行って細胞を回収する。改変AGPC法によって細胞からmRNAを単離する。rtPCR法でムチン合成酵素発現量の上昇を確認する。これによって、大腸ムチン合成に有効な画分の特定作業を行う予定である。並行して、6週齢のSD系雄性ラットを用い、AIN93を基本とした標準飼料で14日間飼育する。飲水は抗生物質添加水 (2 mg/mL ネオマイシン、0.5 mg/mL セフォペラゾン、50 units/mL ベンジルペニシリン) を自由飲水させる。飼育開始10日後に新鮮便を回収する。回収した糞便の有機酸量および分解酵素活性を測定し、腸内細菌によるムチン分解がないことを確認する。その後の本飼育期間では対照食または5%ビートファイバー添加食で14日間飼育する。飲水は水道水を自由飲水させる。毎朝今年度選択された菌株を経口投与する (1.8x109 cfu/head/day)。この間、飼料摂取量、体重、糞便量、糞中ムチン量の推移を記録する。最終日に安楽死させ、盲腸を摘出する。盲腸組織は盲腸壁の組織学的観察と上皮組織のムチン合成酵素遺伝子発現量を解析するために用いる。盲腸内容物は植菌した細菌数をqPCR法で測定する。これにより選択された菌の大腸粘液合成促進作用を検証する。
|
| Causes of Carryover |
全て物品費由来である。薄層クロマトグラフィーに用いる薄層プレートと展開溶媒の購入に使用する予定であったが、現在分画途中であり、手持ちの備品で足りていたため、追加購入に至っていない。本年度は更なる分画が進み、必ず不足するため、このお金を薄層プレートと展開溶媒の購入にあてる。
|
Research Products
(2 results)
