2018 Fiscal Year Research-status Report

NAD+代謝のトランスオミクス解析

Research Project

Project/Area Number	18K11072
Research Institution	Shimane University
Principal Investigator	原伸正島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 講師 (20284028)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	NAD+代謝 / ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ / ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ / サーチュイン
Outline of Annual Research Achievements	加齢性疾患がさまざまな臓器のNAD+レベルの減少と関連し、NAD+レベルを増加させ、長寿に関わるとされるNAD+依存性脱アセチル化酵素サーチュイン（SIRT）を活性化することがこれら疾患の予防および治療に有益であると考えられている。そのため細胞内NAD+濃度（[NAD+]）制御の機序解明は重要である。本研究では、安定同位体標識NAD+前駆体を用いてNAD+合成・分解速度を[NAD+]とともに質量分析により定量する。NAD+合成・分解酵素活性、NAD+合成・分解速度、[NAD+]の階層でのトランスオミクス解析を行い、[NAD+]調節におけるNAD+合成・分解酵素の関与を定量的に解析し、[NAD+]の調節機序を明らかにすることを目的とする。そのため、種々の哺乳動物細胞に加え、NAD+合成の律速酵素であるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(Nampt）およびNAD+分解酵素 PARP-1 (ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ-1)の発現を変化させた細胞を用意し、先のトランスオミクス解析を行う。平成３０年度は、様々な哺乳動物株化培養細胞および初代培養細胞を用いて、[NAD+]は細胞の種類が異なっても400-700 μMと比較的一定に保たれること、細胞のNampt酵素活性の高低に関わらずNAD+合成速度および[NAD+]は狭い範囲に保たれること、合成速度と分解速度はつり合うことを明らかにした。さらにNamptの発現を強制的に増加させても、NAD+合成速度は比例して増加せず、さらに分解速度も同程度に増加すること、結果として[NAD+]は顕著に増加しないことを明らかにした。このNAD+合成と分解の緊密な連関のメカニズムの解明は、[NAD+]を増加させSIRTを活性化すること、従って加齢性疾患の予防および治療につながるものと期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 理由当初の計画どおり哺乳動物株化培養細胞Fao、HepG2、HeLa、HEK293、Caco-2などの由来も大きさも異なる細胞において、Nampt酵素活性、NAD+合成・分解速度、細胞内NAD+濃度（[NAD+]）の階層でのトランスオミクス解析を行い、これら因子間の相関を解析した。当初の計画には無かった非がん細胞株C2C12、H9c2細胞やラット心筋初代培養細胞においても同様の解析を行い、哺乳動物細胞におけるNAD+代謝の普遍的なデータを得た。さらに平成31年度に予定していたNAD+合成の律速酵素であるNamptの発現量を強制的に増加させた細胞におけるNampt活性、NAD+合成・分解速度、[NAD+]の定量も実施し、一定のデータを得ることができた。一方でNAD+分解酵素の活性は測定に至らず平成31年度に持ち越しとなった。
Strategy for Future Research Activity	平成31年度以降では、NAD+分解酵素PARP-1活性、NAD+分解速度、細胞内NAD+濃度（[NAD+]）の相関を解析する。さらに誘導発現系やRNA干渉法によりNamptとPARP-1の発現を段階的に増減させ、これら酵素活性、NAD+合成・分解速度、[NAD+]の連関を調べる。これらNamptとPARP-1の発現を段階的に変動させた細胞において、SIRTの代表的な標的タンパク質であるPGC1αのアセチル化レベルを測定し、これら酵素の発現レベルのSIRT酵素活性に及ぼす効果を解析する。
Causes of Carryover	（状況）購入予定試薬の価格改定のため、残額では購入できなかった。（使用計画）次年度経費に組込み、予定試薬を購入する。