2019 Fiscal Year Research-status Report
脂質スフィンゴミエリンの合成系によって制御される筋肥大の解明と筋肥大促進法の開発
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18K11089
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| Research Institution | Okayama University of Science |
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Principal Investigator |
長田 洋輔 岡山理科大学, 理学部, 講師 (50401211)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | スフィンゴミエリン / スフィンゴミエリン合成酵素 / C2C12 / 骨格筋 / 筋肥大 / 筋分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨格筋はわれわれが体を動かすために必要な組織であり，加齢に伴う運動機能の低下を防ぐためには骨格筋の再生能と可塑性のメカニズムを解明し，筋量を維持する方法を開発することが有効と考えられる．骨格筋の機能を担う筋線維は多数の筋前駆細胞の融合によって形成され，筋肥大の際には既存の筋線維に新たな筋前駆細胞が融合する．本研究は骨格筋の細胞融合に膜脂質の一種であるスフィンゴミエリンが関与する可能性に注目し，そのメカニズムの解明と，スフィンゴミエリン合成系の操作によって筋肥大の促進を図る方法の開発を目指している．
当年度には骨格筋細胞株C2C12を用いた解析を行い，スフィンゴミエリン合成酵素Sms1，Sms2の強制発現によって通常よりも筋核数の多い巨大な筋管が形成されること，siRNAを用いたノックダウンによって筋管形成が抑制されることを明らかにした．これらの結果はスフィンゴミエリンが筋細胞の融合に対して促進的に作用することを示唆している．なお，Sms2に比べてSms1をノックダウンした場合に強い影響が見られたことから，通常の筋形成においてはSms1が中心的な役割を担っている可能性が考えられる．
また，ヒトにおいても同様のメカニズムが働くかどうかを検証するため，ヒト不死化筋芽細胞株(Hu5/KD3細胞)を用いた検討を開始した．筋細胞はmTOR/S6K依存的シグナルによって筋肥大のコントロールが行われることから，筋管形成後にIGFによる刺激を行ったところ，C2C12細胞よりも感度良くmTORおよびS6Kの活性化シグナルが検出できることが明らかになった．※Hu5/KD3細胞は橋本有弘先生（国立研究開発法人国立長寿医療研究センター）から分与していただきました．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当年度は，マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞を用いてスフィンゴミエリン合成酵素による筋形成調節機構の解明を目的として研究を行った．C2C12細胞にスフィンゴミエリン合成酵素をTet-ON発現誘導系によって強制発現させる実験系を構築し，強制発現を行う時期が早いほど筋管が肥大化することが明らかになった．また，siRNAを用いたノックダウンによるSms1あるいはSms2機能阻害実験に加えて，Tet-ON発現誘導系によってSms1あるいはSms2に特異的なmiRNAを発現させ，Sms1あるいはSms2が必要となる時期を明らかにする予定であったが，構築したmiRNA発現ベクターでは十分なノックダウンが起こらなかった．この点については標的配列の変更によって改善が見込めることから，次年度は複数の標的配列を設計し，より効果的なmiRNA発現ベクターを構築して実験を進めたい．
筋肥大にはmTOR/S6K依存的シグナル伝達系が関与すると報告されており，昨年度にはC2C12細胞を用いてmTOR，S6Kの活性を検出する実験系を検討した．当年度は，ヒト不死化筋芽細胞株(Hu5/KD3細胞)を用いて，IGF等の筋肥大誘導刺激によるてmTOR，S6Kの活性を検出する実験系を検討した．その結果，Hu5/KD3細胞ではC2C12細胞よりも感度良くウェスタンブロット法によってmTOR/S6Kシグナルの活性化が検出できることがわかった．次年度には，Hu5/KD3細胞に対してsiRNAを用いたSms1あるいはSms2のノックダウンと強制発現を行い，ヒト筋細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素の重要性を明らかにする．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はスフィンゴミエリンが関与する筋分化のメカニズムを調べる．Sms1あるいはSms2の強制発現およびノックダウンによる影響が筋細胞の増殖，分化，融合のどの段階に現れたのかをトランスクリプトーム解析，定量的RT-PCR，ウェスタンブロット，免疫細胞化学的解析によって検証する．特に細胞融合に関与している可能性が高いため，筋前駆細胞の融合に関与することが報告されているホスファチジルセリン，M-カドヘリン，Rac1，フリッパーゼ，PIEZO1等について発現，局在，活性等の解析を行う．
また，C2C12細胞およびHu5/KD3細胞に対して種々の薬剤の添加し，スフィンゴミエリンを免疫細胞化学的に検出することによって，スフィンゴミエリン合成を活性化させる薬剤の探索を行う．筋肥大はmTOR/S6Kシグナルによってコントロールされることが報告されているため，スフィンゴミエリンが関与する筋形成の変化にもmTOR/S6Kシグナルが関与しているかどうかをウェスタンブロット法によって解析する．
さらに，マウス骨格筋から単離・培養した筋サテライト細胞を用いて，より生体内に近い実験系で検証する．初代培養筋細胞では骨格筋に特徴的な横紋構造が形成され，自発的な収縮を開始することを利用して，スフィンゴミエリン合成系の操作によって肥大した筋線維が正常なものと相違ないかについても検証を行う．また，骨格筋のコラゲナーゼ処理によって単離する単一筋線維を利用して，筋線維そのものの肥大や萎縮とスフィンゴミエリン合成系の関係を調べる．
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| Causes of Carryover |
当年度は発現ベクターの調製と安定発現株の樹立のための実験を行ったが，十分なノックダウン効率を発揮するmiRNAベクターを得ることができなかった．この点に関しては，miRNA配列を変更することによって改善できるため，次年度には複数のターゲット配列を設計し，最も効果的なmiRNAベクターを採用することを計画している．クローニングのために必要な試薬や，強制発現およびノックダウンによって変化する遺伝子発現解析のために必要なリアルタイムPCR試薬や，ウェスタンブロット用の抗体，培養液，成長因子・サイトカイン等を購入して研究を実施する．
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