2018 Fiscal Year Research-status Report
The study of lipid dynamics regulating the activity of membrane proteins
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18K11135
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
早川 枝李 自治医科大学, 医学部, 助教 (00383753)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ABCトランスポーター / 脂質膜のcurvature stress / 分子間パッキング / 脂質分子間側方ストレス / 脂質メディエーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、脂肪酸の種類の違いがもたらす生体や細胞への効果が注目されている。中でもω３-、ω６-脂肪酸を含む多価不飽和脂肪酸は学習機能の亢進、うつ病の軽減・改善、神経細胞の新生・発達など、個体レベルから細胞レベルまで幅広い効果が報告され、脂質メディエーターとして注目されている。しかしこれらの脂肪酸を含むし脂質の作用機序が、たとえば、細胞膜に発現しているレセプターから細胞内に取り込まれた結果なのか、細胞膜を構成する脂肪酸組成の変化と共存する膜タンパク質の活性に対する影響はどうなのかなど、分子レベルでの脂肪酸の機能についてはいまだ不明な点が多い。本研究では機能性脂質として注目されているω３－脂肪酸、ω６－脂肪酸を始めとする多価不飽和脂肪酸や不飽和脂肪酸を用いて作成した人工脂質膜に膜タンパク質を再配向させて人工細胞膜を作製し、異なる脂肪酸の組み合わせにより膜タンパク質の機能がどのように調節されるか分子レベルで明らかにすることを目的とする。膜タンパク質は、脂質の恒常性維持や薬剤排出機構に重要な役割を示すATP binding cassette (ABC) transporter ファミリーのうち、ABCA1とABCG1を用いて検討する。実験の流れは、（Ａ）それぞれの膜タンパク質の大量発現、（Ｂ）カラムで分離、精製、（Ｃ）濃縮、（Ｄ）人工脂質二重層膜に再配向、（Ｅ）人工膜へ配向しているかどうかの確認、（Ｆ）各実験項目の遂行、とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ｈ３０年度は本研究に不可欠である膜タンパク質の準備として、（Ａ）それぞれの膜タンパク質の大量発現、（Ｂ）カラムで分離、精製、（Ｃ）濃縮、まで行った。当初は１種類の膜タンパク質を作成することを目指し、その後、実験に用いることを計画していたが、実際に行ってみると予想よりもスムーズにできたことから、先に膜タンパク質（2種）を作成することにした。現在までABCG1について大量発現、カラムで分離、精製、濃縮、ウェスタンによるバンドの確認まで完了している。また、ABCA1について、大量発現、カラムで分離、精製まで終了し、近いうちに2種の膜タンパク質が材料としてそろう目途がついた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ｈ３１年度は、①実験に必要な膜タンパク質については大量発現→精製・濃縮、までの作業を継続して繰り返す（＝一度に大量に精製できないため）。②人工脂質膜に膜タンパク質（＝人工細胞膜）を再配向できたかどうか検討するための確認実験を行う。現時点ではクライオ電子顕微鏡を用いた確認実験を検討している。③人工脂細胞膜の形成が確認できたのち、膜タンパク質の活性測定を行う。④膜タンパク質の活性は、共存する脂質分子から受ける側方ストレスに影響を受ける。そこで各種脂肪酸を用いて異なる脂質分子間に発生する側方ストレスのタンパク質への影響を検討するため、周波数変換蛍光寿命測定装置を用いて測定を行う。本実験に必要な装置は日本国内にないため、米国に数か月滞在して測定を行うこととする。
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| Causes of Carryover |
過年度はマテリアル（膜タンパク質）の作成を行うことに集中し、無事に精製過程まで終了することができた。そこで本年度、次年度（最終年度）は、各種脂肪酸の構造・物理的作用と膜タンパク質の活性との関係を実際に検討（実験）するため、米国出張（数か月滞在）を含めた実験に用いる消耗品、機器使用料、旅費、成果発表費（論文投稿、校正費）などに本助成金を使用する。
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