Roles of PDXDC1 in the decarboxylation of phenylalanine.

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K11137
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 鈴木 良雄 順天堂大学, スポーツ健康科学部, 先任准教授 (30612395)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: フェニルアラニン / 脱炭酸 / アミノ酸バランス / HEK293 / 大腸菌発現系

Outline of Annual Research Achievements

生体内の遊離アミノ酸濃度にはそれぞれのアミノ酸に標準範囲（アミノ酸バランス）があることが知られており、アミノ酸濃度のインバランスと体調や疾病との関連が注目されている。一方、アミノ酸必要量を測定する指標アミノ酸酸化法（IAAO法）では必須アミノ酸バランスの不均衡に応答したフェニルアラニン（Phe)の脱炭酸を測定している。このように生体内でアミノ酸バランスが保たれていることは当然のことと考えられているが、アミノ酸バランスの認識・生成のメカニズムにはまだ明らかなっていない。
一方、ドーパ脱炭酸酵素（DDC）もPheの脱炭酸行うことが知られているが、発現しいている組織が限られており、全身でのアミノ酸バランスに応じたＰｈｅ脱炭酸に関与しているとは考えられない。
そこで、アミノ酸バランス認識・生成機構を探るための糸口として、機能未知の脱炭酸酵素ドメインを持つタンパクPDXDC1とPhe脱炭酸との関係を検討する。
本研究ではPDXDC1がアミノ酸不均衡に応答してPheを分解する経路に関与していることを明らかにするとともに、その調節機構を検討することを目的とするが、これまでにヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞について、DDCを発現していないことPCRで確認し、siRNAによりPDXDC1をノックダウンするとPhe脱炭酸が抑制されることから、PDXDC1がPheの脱炭酸に関与することを確認している。また、HEK293細胞で発現しているPDXDC1をpET28aベクターにクローニングしている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度までは、HEK293細胞でのDDCとPDXDC1の発現はRNAレベルで確認していたが、タンパクレベルでは確認していなかった。またPDXDC1は脱炭素酵素ドメインの下流に機能未知領域をもち、この領域が細胞内局在や脱炭素酵素活性調節に関与している可能性も示唆された。
そこで、HEK293でのDDCとPDXDC1の発現をタンパクレベルで確認するとともに、PDXDC1の大腸菌発現系を構築し、機能の確認を行った。
HEK293細胞とヒト肝がん由来HepG2細胞でのPDXDC1とDDCのタンパク発現をWestern blottingにより確認しHEK293細胞にはPDXDC1、HepG2細胞にはPDXDC1とDDCが発現していることがタンパクレベルでも確認した。また、pET28 plasmidを用いて全長のPDXDC1（PDXDC1_WT）と脱炭酸酵素ドメインの下流の機能未知を欠失させたPDXDC1（PDXDC1_⊿C）を作成し、E. coli BL21(DE3)にて発現させた。PDXDC1_WTとPDXDC1_⊿Cの発現はWestern blottingにより確認した。。Phe脱炭酸はPDXDC1_WT とPDXDC1_⊿Cの両者を発現したE.coli抽出液で確認され、PDXDC1_⊿Cの活性はPDXDC1_WTの131%であった。E.coliには、DDC、PheDCの存在は確認されていないことから、E.coliに導入したPDXDC1_WT 、PDXDC1_⊿CによってPhe脱炭酸が生じたと考えられる。これによりPDXDC1がPheを脱炭酸するPheDCであることが確認され、脱炭酸酵素ドメインの下流の機能蜜領域が酵素活性を調節してる可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

E. coli発現系でのPDCDC1の活性は、E. coli抽出液を用いて反応を行い、反応生成物であるフェネチルアミンをo-フタルアルデヒドによりポストカラム修飾しHPLCにより確認した。反応で生じるフェネチルアミン以外の物質でHPLCの保持時間がフェネチルアミンと一致し、フェネチルアミンと同様に検出されるものを測定している可能性も否定できないため、反応生成物のLC/MS/MSによる確認を試みている。夾雑物によりマスクされてしまう可能性もあるため、E. coliで発現させたPDXDC1を精製し、酵素活性をより明確に確認する。また、精製酵素を用いて酵素特性を明確に確認する。上記と並行して、HEK293細胞で培地の必須アミノ酸バランスを不均衡にしたときのPDXDC1の、(1) 切断による大きさの変化、(2) リン酸化（Ser/Thr、Tyr）および (3)ニトロ化（Trp、Tyr）状態の変化を検討する。切断あるいは修飾が起きていた場合には、切断あるいは修飾されたPDXDC1を二次元電気泳動で回収し、トリプシン等による限定加水分解の後LC/MSにより、切断部位や修飾部位を特定する。 次いで、(4) 結合もしくは解離する補助因子があるかを、活性化状態と非活性化状態のPDXDC1を免疫沈降しLC/MS等により確認する。
上記により、アミノ酸バランスに応答したPhe脱炭酸におけるPDXDC1の役割とそのメカニズムを明らかにする。

Causes of Carryover

E. coli発現系でのPDCDC1の活性測定で、LC/MS/MSによる活性の確認に約4か月を要し、しかも結果が明確に得られなかったため、酵素特性の検討や細胞レベルでの挙動の研究がストップしてしまった。そのために次年度使用額が生じてしまった。今年度はE. coliで発現させたPDXDC1の精製と酵素特性の解析と並行して、HEK293細胞で培地の必須アミノ酸バランスを不均衡にしたときのPDXDC1の挙動の検討を進める予定である。