Roles of PDXDC1 in the decarboxylation of phenylalanine.

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K11137
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 鈴木 良雄 順天堂大学, スポーツ健康科学部, 教授 (30612395)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: フェニルアラニン / 脱炭酸 / アミノ酸バランス / HEK293 / 大腸菌発現系

Outline of Annual Research Achievements

生体内の遊離アミノ酸濃度にはそれぞれのアミノ酸に標準範囲があることが知られており、アミノ酸濃度のインバランスと体調や疾病との関連が注目されている。一方、アミノ酸必要量を測定する指標アミノ酸酸化法（IAAO法）では必須アミノ酸バランスの不均衡に応答したフェニルアラニン（Phe)の脱炭酸を測定している。このように生体内ではアミノ酸バランスが保たれているが、その認識・生成のメカニズムは明確ではない。一方、ドーパ脱炭酸酵素（DDC）もPheの脱炭酸を行うことが知られているが、発現している組織が限られており、全身の組織でアミノ酸バランスに応じたPhe脱炭酸に関与しているとは考えにくい。
そこで、アミノ酸バランス認識・生成機構を探るための糸口として、機能未知の脱炭酸酵素ドメインを持つタンパクPDXDC1とPhe脱炭酸との関係を検討するのが本研究の目的である。
本研究では以下を行った。１）ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞がDDCを発現していないことをPCRおよびウェスタンブロッティングで確認した。２）HEK293細胞で、siRNAによりPDXDC1をノックダウンするとPhe脱炭酸が抑制されることを確認した。３）HEK293細胞で発現しているPDXDC1をpET28aベクターにクローニングし、全長及び脱炭酸酵素ドメインのみの大腸菌での発現系を確立した。４）大腸菌で発現させたPDXDC1（全長、脱炭素酵素ドメイン）をHis-Tagを用いて精製し、脱炭酸活性を測定したが、Pheの脱炭酸活性は認められなかった。５）Pheの脱炭酸で生じるフェネチルアミン（PheNH2）を水酸化アンモニウムを含む塩基性溶出液で分離し、UV及びMSで検出できる条件を確立した。６）マウス5週齢のICR系雄性マウスを対象に肝臓、腎臓、小腸、心臓、腓腹筋でのPDXDC1の発現をウェスタンブロッティングにより確認した。