2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K11639
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
黒谷 賢一 名古屋大学, 生命農学研究科, 研究員 (10402778)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡 泰由 名古屋大学, 環境医学研究所, 特任助教 (60762383)
荻 朋男 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80508317)
嶋田 繭子 名古屋大学, 環境医学研究所, 技術補佐員 (80623834)
唐田 清伸 名古屋大学, 環境医学研究所, 客員研究者 (90345017) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | DNA損傷応答 / インタラクトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA損傷応答 (DNA damage response, DDR)はゲノムの安定化に極めて重要な反応である。DDR蛋白質の細胞内での機能を理解するためには、蛋白質-蛋白質間の相互作用 (Protein-protein interaction, PPI)ネットワークを詳細に知る必要がある。本研究では、精密質量分析装置を利用した、ヒト細胞におけるDDR蛋白質の網羅的インタラクトーム解析を実施する。
2018年度は、インタラクトーム解析を生理的条件下で実施するために、ゲノム編集技術を利用し、標的遺伝子のC末端領域にタグ遺伝子配列と薬剤選択遺伝子配列の導入を検討した。タグ遺伝子には、導入確認を行うためのmClover配列を、インタラクトーム解析を実施するために、Strep配列を用いた。薬剤選択遺伝子を導入することで、クローニングのステップをスキップすることで、ハイスループットな解析が可能となることが期待される。細胞内で比較的高コピー数の蛋白質に関しては、ゲノム編集後の細胞を蛍光顕微鏡下で確認した際に、mCloverシグナルを確認することができた。しかしながら、低コピー数の蛋白質に関しては、ゲノム配列ではタグの挿入を確認できたにも関わらず、蛍光顕微鏡下ではmCloverシグナルを検出することができなかった遺伝子が複数見られた。標的遺伝子のC末端領域へのタグ付加により蛋白質の安定性が低下したことで、蛍光顕微鏡による検出限界に到達していないことが考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
網羅的インタラクトーム解析を内在性蛋白質に対して実施するために、ゲノム編集技術を利用した、mClover、Strep、薬剤耐性遺伝子の導入を検討したが、ゲノム配列ではタグ配列の挿入を確認できたにも関わらず、蛋白質の発現を検出することができなかった標的遺伝子が複数見られた。当初は、HDRによるゲノム編集技術を利用し、クローニングステップ不要な実験系を構築することで、ハイスループットな解析を実施することを計画していた。しかしながら、ゲノム編集技術を利用したハイスループットな、内在性蛋白質を標的としたインタラクトーム解析に加え、外来遺伝子 (cDNA導入により発現させた蛋白質)に対する解析を検討する必要性が出たため。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度は、生理的条件下でのインタラクトーム解析を目的とした、内在性遺伝子へのゲノム編集技術を用いたタグ付加反応を、昨年度に引き続き実施する。また、外来遺伝子を細胞へ導入し発現させた蛋白質に対しても、インタラクトーム解析の実施準備を行う。すでに作製済みのインタラクトーム解析用内在性遺伝子タグ付加された細胞に関しては、順次、精密質量分析装置を用いたインタラクトーム解析を実施する。Strepタグに対するプルダウンの条件、質量分析のためのサンプル調整に関しても、条件検討を実施する。DDR蛋白質のインタラクトーム解析により、新規蛋白質-蛋白質間相互作用、ならびに機能未知の蛋白質との相互作用が検出された際には、分子生物学的手法を用いた解析を実施する。具体的には、標的蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降法により、質量分析装置で得られた実験結果の確認を行う。また、機能未知蛋白質の細胞内で役割を検討するため、ゲノム編集技術により機能喪失させた細胞を作製し、DDRへの関与の有無を検討する。
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| Causes of Carryover |
当初は、精密質量分析装置を用いたインタラクトーム解析を実施し、得られたデータを解析するために必要な物品の購入を予定していた。しかしながら、解析に十分なデータが得られず、次年度に使用することとしたため。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Functional and clinical relevance of novel mutations in a large cohort of patients with Cockayne syndrome2018
Author(s)
Calmels N, Botta E, Jia N, Fawcett H, Nardo T, Nakazawa Y, Lanzafame M, Moriwaki S, Sugita K, Kubota M, Obringer C, Spitz MA, Stefanini M, Laugel V, Orioli D, Ogi T§, Lehmann A.
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Journal Title
Journal of Medical Genetics
Volume: 55
Pages: 329～343
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Cerebellar ataxia-dominant phenotype in patients with ERCC4 mutations2018
Author(s)
Doi H, Koyano S, Miyatake S, Nakajima S, Nakazawa Y, Kunii M, Tomita-Katsumoto A, Oda K, Yamaguchi Y, Fukai R, Ikeda S, Kato R, Ogata K, Kubota S, Hayashi N, Takahashi K, Tada M, Tanaka K, Nakashima M, Tsurusaki Y, Miyake N, Saitsu H, Ogi T, Aihara M, Takeuchi H, Matsumoto N, Tanaka F.
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Journal Title
Journal of Human Genetics
Volume: 63
Pages: 417～423
DOI
Peer Reviewed
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