デザインされた誘発Dicによる微小核/クロモトリプシス形成過程の解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K11647
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 津山 尚宏 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (10335747)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 悠 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00722472) ; 柳 亜希 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (60803525) ; 坂井 晃 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70284221)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 二動原体染色体 / 微小核 / クロモトリプシス / 放射線発がん / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

電離放射線によるDNA二本鎖切断(DSB)が誘発するランダムな不安定型染色体異常である二動原体染色体(Dicentric Chromosome: Dic)の生物学的重要性は明らかではない。近年、不安定な異常染色体は間期に微小核(Micronucleus: MN) を 形成し、さらにクロモトリプシス（染色体破砕）を起こして複雑に融合した安定な異常染色体となり、発癌に寄与することが示唆されている。Dicの同期的誘導を可能にするため、11番染色体CCND1遺伝子の5’側領域、14番染色体のIgH鎖Eμ領域の各々に特異的なgRNA配列をデザインし、効率よく切断が起きることを確認した。また、それぞれのゲノム領域に相同組換を用いてloxPを導入するための鋳型となるtargetting vectorを作成した。これらを用いて、CRISPR/Cas9による特異的な切断を起こし、相同組換によりそれぞれloxPをノックインしたHEK293細胞を作成した。loxPは、Dicおよび転座が生成されるようにKnock-Inベクターを2種作成し細胞株もそれぞれ作成した。Dicおよび転座の誘導は、GFPを共発現するCreレコンビナーゼを一過性に導入・GFP陽性細胞のセルソーター分離やTetOffによるCre誘導で行った。PCRにより転座の誘導は確認できたが、確率は0.1％以下と大変低く、またDicはさらに低頻度であった。転座誘導細胞については、細胞を純化しPCRやDNA配列解析によりloxPを介した染色体転座が起こっていることを確認できた。同期的に誘導された細胞を大量に回収し様々な解析に用いるため、Dic誘導細胞のみを単離できるマーカーをloxPとともに予め導入する実験系を計画した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初予定していた、Cre/loxPのみで染色体異常を誘発する方法ではDicが生じる効率が低く、大量にDicをもつ細胞を得ることが難しい。そのため誘導された細胞のみを単離する方法に変更するために、相同組換の鋳型ベクターを再構築している。

Strategy for Future Research Activity

Dicが誘導された細胞を効率よく回収するために、現在、Dicが誘導された場合にのみプロモータートラップによりGFPが発現するよう、loxPとともにPGKプロモーターあるいはGFPを、11番および14番染色体にKnock-Inしておき、誘導後のGFP+細胞をソーティングすることによりDic生成細胞を単離し解析するべく、ベクターを構築中である。また染色体異常の標的領域や染色体の組み合わせについても検討を行っている。

Causes of Carryover

実験の効率を上げるために研究計画を変更したため、次年度使用額が生じた。変更した研究計画に基づき、次年度の助成金を使用する。

Research Products

• [Journal Article] Dose-response curves for analyzing of dicentric chromosomes and chromosome translocation following doses of 1,000 mGy or less based on irradiated peripheral blood samples from 5 healthy individuals. (2018)
  • Author(s): Abe Y, Yoshida MA, Fujioka K, Kurosu Y, Ujiie R, Yanagi A, Tsuyama N, Miura T, Inaba T, Kamiya K, Sakai A
  • Journal Title: Journal of Radiation Research Volume: 59 Pages: 35-42
  • DOI: 10.1093/jrr/rrx052.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Analysis of the number of chromosome aberrations induced by three consecutive CT examinations. (2019)
  • Author(s): Yu Abe, Hideyoshi Noji, Misaki Sugai, Yumiko Kurosu, Naohiro Tsuyama, Aki Yanagi, Yukari Yanai, Takashi Ohba, Tetsuo Ishikawa, Tomisato Miura, Kenji Kamiya, Mitsuaki A. Yoshida, Akia Sakai
  • Organizer: 放射線災害・医科学研究拠点 第３回国際シンポジウム
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Induction of t(11;14) IgH enhancer/promoter-cyclin D1 gene translocation using CRISPR/Cas9. (2019)
  • Author(s): Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Aki Yanagi, Misaki Sugai, Kenji Kamiya, Akira Sakai
  • Organizer: 放射線災害・医科学研究拠点 第３回国際シンポジウム
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CRISPR/Cas9を用いたt(11; 14)染色体転座誘発 (2018)
  • Author(s): 津山尚宏、阿部悠、柳亜紀、菅井美咲、神谷研二、坂井晃
  • Organizer: 第61回日本放射線影響学会
• [Presentation] Investigation of the cumulative number of chromosome aberrations induced by three consecutive CT scans. (2018)
  • Author(s): Yu Abe, Hideyoshi Noji, Misaki Sugai, Yumiko Kurosu, Takashi Ohba, Naohiro Tsuyama, Aki Yanagi, Yukari Yanai, Tetsuo Ishikawa, Tomisato Miura, Kenji Kamiya, Mitsuaki A Yoshida, Akira Sakai
  • Organizer: American Association for Cancer Research Annual Meeting 2018.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Construction of dose response curves for cytogenetic biodosimetry in the low dose range based on five persons. (2018)
  • Author(s): Yu Abe, Mitsuaki A Yoshida, Kurumi Fujioka, Yumiko Kurosu, Risa Ujiie, Aki Yanagi, Naohiro Tsuyama, Tomisato Miura, Toshiya Inaba, Kenji Kamiya, Akira Sakai
  • Organizer: EPRBioDose 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of the number of chromosome aberrations induced by three consecutive CT examinations. (2018)
  • Author(s): Abe Y, Noji H, Sugai M, Kurosu Y, Tsuyama N, Yanagi A, Yanai Y, Ohba T, Ishikawa T, Miura T, Kamiya K, Yoshida MA, Sakai A
  • Organizer: 第61回日本放射線影響学会
• [Presentation] ttempt to make abnormal B lymphocytes as myeloma-initiating cells from iPSs. (2018)
  • Author(s): 柳 亜希、津山尚宏、柳井祐佳里、阿部 悠、菅井美咲、太田明伸、シバスンダラン カルナン、笹谷めぐみ、神谷研二、花村一朗、池添隆之、小野寺雅史、坂井 晃
  • Organizer: 第80回日本血液学会学術集会
• [Presentation] Attempt to prove the existence of abnormal B lymphocyte as myeloma-initiating cells from B cell-derived induced pluripotent stem cells. (2018)
  • Author(s): Yanagi A, Tsuyama N, Yanai Y, Abe Y, Sugai M, Ota A, Sivasundaram K, Shigemura T, Sasatani M, Kamiya K, Hanamura I, Ikezoe T, Onodera M, Sakai A
  • Organizer: 60th ASH Annual Meeting.
  • Int'l Joint Research