2019 Fiscal Year Research-status Report
デザインされた誘発Dicによる微小核/クロモトリプシス形成過程の解析
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18K11647
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
津山 尚宏 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (10335747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 悠 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00722472)
柳 亜希 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (60803525)
坂井 晃 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70284221)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 二動原体染色体 / 微小核 / クロモトリプシス / 放射線発がん / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電離放射線に特徴的に生じるDNA損傷は二本鎖切断(DSB)で、その結果ランダムな不安定型染色体異常である二動原体染色体(Dicentric Chromosome: Dic)が誘発される。Dicは間期に微小核(MN)となり、さらにクロモトリプシス（染色体破砕）を起こして複雑に融合した異常染色体となり、発癌に寄与することが示唆されている。Dicの生物学的重要性を検討するため、同期的誘導実験系の確立と解析を試みた。
11番染色体CCND1遺伝子12kb上流、14番染色体のIgH鎖Emuの各々にCas9により特異的切断を生じるgRNA配列を設定した。さらに、それぞれのゲノム領域の鋳型ベクターを作成し、CRISPR/Cas9切断に続く相同組換を用いてloxPを導入したHEK293細胞を作成した。loxPの方向はDicおよび転座が生成されるように2種作成し、TetOff制御によりCreレコンビナーゼを一過性に発現させたところ、PCRにより転座やDicの生成は確認できたが、確率は0.1％以下と大変低かった。
同期的に誘導された細胞を大量に回収し様々な解析に用いるため、Cre/loxP によりDic誘導されるとPromoter-loxP-GFPが生じ誘導細胞が蛍光を示す実験系を作成した。11番染色体にPGK promoter-loxPを、14番染色体にloxP-GFPをCRISPR/Cas9によりKnock-inし、TetOff制御CreによりDicを誘導できる細胞株を構築した。これに加えレンチウイルスを用いてPromoter-loxP及びloxP-GFPをランダムに挿入した細胞株も構築した。これらを用いて誘導されたDicをもつ細胞を効率よく回収し、Dicの消長とDicの存在が細胞に与える影響について、様々な分析法により解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の当初の予定に従い作成した二動原体染色体誘導系の効率が低く、誘導を蛍光でモニターするための実験系を再構築したため、計画が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
作成した細胞を用い、Dicが生じた細胞をGFPの蛍光を指標に効率よくセルソーターで回収する方法を確立する。また回収した細胞を用い、RT-PCRによる遺伝子発現の変化やウェスタン解析によるタンパク質修飾の変化、MNやクロモトリプシスを経て安定型染色体異常に至る過程を、染色体ペインティングやイメージングサイトメトリー、プロテオミクスやメタボロミクスなどを用いて細胞周期分布や細胞死頻度などとともに継時的に定性・定量解析を行う。
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| Causes of Carryover |
当初計画の実験方法では効率が悪く実験系を再構築したため、予定していた実験が遂行できなかった。
再構築した実験方法を用いて、研究計画に従い予定していた実験を逐次遂行する。
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[Presentation] Chromosomal translocation t(11;14) and p53 deletion in B cell-derived iPS cells by CRISPR/Cas9.2019
Author(s)
Aki Yanagi, Naohiro Tsuyama, Misaki Sugai, Yu Abe, Yukari Yanai, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Lobna Alkebsi, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai
Organizer
第81回日本血液学会学術集会
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[Presentation] Introduction of Chromosomal Translocation t(11; 14) and a p53 Deletion into Normal B Cell-derived iPSCs to Elucidate the Cellular Origin of Myeloma Cells.2019
Author(s)
Yanagi A, Tsuyama N, Sugai M, Abe Y, Azami Y, Yanai Y, Ota A, Sivasundaram K, Muramatsu M, Shigemura T, Sasatani M, Hashimot Y, Kamiya K, Hanamura I, Ikezoe T, Onodera M, Sakai A
Organizer
61th ASH Annual Meeting
Int'l Joint Research
