2020 Fiscal Year Research-status Report
デザインされた誘発Dicによる微小核/クロモトリプシス形成過程の解析
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18K11647
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
津山 尚宏 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (10335747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 悠 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00722472)
柳 亜希 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (60803525) [Withdrawn]
坂井 晃 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70284221)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 二動原体染色体 / 微小核 / クロモトリプシス / 放射線発がん / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電離放射線により生じるDNA二本鎖切断(DSB)の結果、ランダムな染色体異常が生成する。中でも不安定型染色体異常である二動原体染色体(Dicentric Chromosome: Dic)は、喚起に微小核(MN)形成を介して細胞質自然免疫や細胞老化機構を活性化したり、クロモトリプシス（染色体破砕）を起こして複雑に融合した異常染色体となり、発癌に寄与すると考えられている。このDicを効率よく解析するため、誘導実験系の確立を試みた。
11番染色体CCND1遺伝子上流、14番染色体のIgH鎖にCas9によるゲノム編集をもちいloxPを導入したHEK293細胞を作成しCreによるDicの生成は確認できたが、Dicの誘導効率が想定よりも大変低く解析に十分なDic生成細胞数を得ることができなかった。
標的座位により染色体異常誘発頻度が異なり、現在の標的座位,IgH遺伝子およびCCND1遺伝子では難しい可能性を考慮し、別の標的座位を用いた実験系も追加で作成中である。他の腫瘍に生じている転座を模するため、非小細胞肺がんでみられるt(5;6)(q33;q22)、5番染色体CD74遺伝子と6番染色体ROS1遺伝子の転座、線維形成性小細胞腫瘍t(11:22)(p13:q12)、11番染色体WT1遺伝子と22番染色体EWSR1遺伝子の転座、についてloxP を転座あるいはDic誘導される向きにそれぞれ挿入できる実験系を作成中である。相同組換に用いる各々の遺伝子のCRISPR/Cas9ベクターは作成済で、locPを導入する相同組換ベクターを作成している。この際、前年度に作成したCre/loxP により転座あるいはDic誘導されるとPromoter-loxP-GFPが生じ蛍光を示す実験系を用いる。さらに任意のタイミングで活性化できるERT2を付加したCreを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
昨年度半ばより、本研究以外の染色体解析研究を担当することになり、一時的に本研究に使うことができる時間がなくなったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
CD74, ROS1, EWSR1, WT1遺伝子のそれぞれについて、gRNAをデザインしてCRISPR/Cas9発現ベクターを構築し、効率よくゲノム編集を起こすことができる標的配列を確認した。現在、転座誘導活性を検討中である。続いてCD74, ROS1, EWSR1, WT1遺伝子へのノックインベクターを構築してHEK293細胞などに各々のCRISPR/Cas9ベクターとともに導入して、標的クローンを得る。このベクターでは前年度に作成した、Cre/loxPにより染色体異常を誘導された細胞のみを単離する解析方法を用いるため、Dicが誘導されるとプロモータートラップによりGFPが発現するよう、PGK promoter-loxPあるいはloxP-GFPをそれぞれの遺伝子内にノックインし、Cre誘導後のGFP+細胞をソーティングすることによりDic生成細胞を単離し解析可能なHEK293細胞を作製する。これらの細胞を用いてCreによりDic誘導を行う。IgH-CCND1遺伝子についても、Dic誘導効率を上げる可能性がある細胞周期同調や相同組換修復/非相同末端結合修復の阻害剤処理などを行い、誘導を試みる。解析はRT-PCRによる遺伝子発現の変化、MNなどを、種々の方法を用いて細胞周期分布や細胞死頻度などとともに継時的に解析をする。
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| Causes of Carryover |
昨年度半ばより、他研究の染色体解析を担当することになり、一時的に本課題を解析する時間が十分に取れなくなったため。
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[Presentation] Chromosomal translocation t(11;14) induced by Cre-loxP system in normal B cell-derived iPS cells.2020
Author(s)
Misaki Sugai, Naohiro Tsuyama, Yu Abe*, Yusuke Azami*, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai.
Organizer
第82回日本血液学会学術集会
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[Presentation] Chromosomal Translocation t(11;14) Induced by the Cre-loxP System in Normal B cell-derived iPS Cells for the Study of Myeloma-initiating Cells.2020
Author(s)
Misaki Sugai, Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Yusuke Azami, Kenichi Kudo, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai.
Organizer
62th ASH Annual Meeting.
Int'l Joint Research
