2021 Fiscal Year Research-status Report
デザインされた誘発Dicによる微小核/クロモトリプシス形成過程の解析
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18K11647
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
津山 尚宏 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (10335747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 悠 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00722472)
柳 亜希 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (60803525) [Withdrawn]
坂井 晃 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (70284221)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 二動原体染色体 / 微小核 / クロモトリプシス / 放射線発がん / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電離放射線により生じるDNA二本鎖切断(DSB)の結果、染色体転座や二動原体染色体などの染色体異常が様々なゲノム領域でランダムに生成する。安定型異常である染色体転座は通常の染色体と同様に分裂期を通じて娘細胞に分配されるが、不安定型染色体異常である二動原体染色体(Dicentric Chromosome: Dic)は間期に細胞質に微小核(MN)形成を形成することが多く、細胞質DNA応答や細胞老化の活性化シグナルとなり、微小核内でクロモトリプシス（染色体破砕）を起こして複雑に融合した異常染色体を形成し、生じた突然変異は発癌に寄与する可能性がある。
Dicを解析するため誘導実験系の確立を試みており、前年度までに11番染色体CCND1遺伝子および14番染色体IgH遺伝子にloxPを導入した細胞を作成し、iCre-loxPあるいはERT2-CreによるDicの生成を試みたが、Dicの誘導効率が10^-7程度と低く解析に十分な細胞数を得ることができなかった。
座位特異的なDic/転座誘導効率の違いを考慮し、他の腫瘍由来の転座を模したDic/転座誘導系を作成した。非小細胞肺がんの5番染色体CD74遺伝子と6番染色体ROS1遺伝子の転座、線維形成性小細胞腫瘍の11番染色体WT1遺伝子と22番染色体EWSR1遺伝子の転座を誘導するCD74/ROS1あるいはEWSR1/WT1 に対するgRNAおよびCas9を共発現するレンチウイルスベクターを作成した。いずれのベクターも導入細胞にDic/転座が誘導できることをゲノムDNAを用いたPCRやRT-PCRにより確認できたため、IgH/CCND1と同様な実験を行いDicの生成誘導を試みる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
引き続き臨床検体の染色体解析に時間を要したため
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| Strategy for Future Research Activity |
CD74/ROS1, EWSR1/WT1遺伝子を標的としたgRNAを発現するCRISPR/Cas9発現ベクターを構築し、転座/Dic誘導活性が確認された。Dicが誘導されるとプロモータートラップによりGFPが発現するよう、PGK promoterあるいはGFPをそれぞれの遺伝子内にノックインし、CRISPR/Cas9導入後のGFP+細胞をソーティングすることによりDic生成細胞を単離し解析可能なHEK293細胞を作製し、Dic誘導を行う。さらに、Dic誘導効率を上げる可能性がある細胞周期同調や相同組換修復/非相同末端結合修復の阻害剤処理などを行い、誘導を試みる。解析はRT-PCRによる遺伝子発現の変化、MNなどを、種々の方法を用いて細胞周期分布や細胞死頻度などとともに継時的に解析をする。
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| Causes of Carryover |
前年度までに購入した既存の試薬を用いて研究遂行が可能であったため、次年度使用額が生じた。
今年度も研究計画に従い、助成金を計画的に使用する予定である。
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[Journal Article] Chromosomal translocation t(11;14) and p53 deletion induced by the CRISPR/Cas9 system in normal B cell-derived iPS cells.2021
Author(s)
Azami Y, Naohiro Tsuyama N, Abe Y, Sugai-Takahashi M, Kudo K, Ota A, Sivasundaram K, Muramatsu M, Shigemura T, Sasatani M, Hashimoto Y, Saji S, Kamiya K, Hanamura I, Ikezoe T, Onodera M, Sakai A.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 11
Pages: 5216-5228
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Study for exploring myeloma-initiating cell using normal B cell-derived iPS cells.2021
Author(s)
Yusuke Azami, Naohiro Tsuyama, Yu Abe, Misaki Sugai-Takahashi, Ken-ichi Kudo, Miwa Fukami, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Shigehira Saji, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai
Organizer
第83回日本血液学会学術集会
