Analysis of mechanisms of mutations from DNA damage using genome editing and site-specifically modified plasmids

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K11656
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 八木 孝司 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80182301)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川西 優喜 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (70332963)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 突然変異 / ゲノム編集 / 損傷乗り越えDNAポリメラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

損傷乗り越えDNA複製（TLS）は、DNAポリメラーゼδとεがDNA損傷で停止した時に、交代して損傷を乗り越えてDNA複製を進めるDNAポリメラーゼであるが、その忠実度は低く突然変異を生じさせる。はたらくTLSポリメラーゼの種類はDNA損傷の種類によって異なるが、損傷の種類とはたらくTLSポリメラーゼの関係は明らかでない。我々はCRISPR/Cas9法によってTLSポリメラーゼ（ΔPolη、ΔPolκ/PIP、ΔPolι）を欠損した色素性乾皮症（XP）細胞（ヌクレオチド除去修復欠損）を作製し、それらを用いて、３ーニトロベンズアントロン（NBA）、紫外線（UV）、シスプラチン（CisPt）の感受性をコロニー形成法で調べた。その結果、ΔPolηXP細胞がいずれの変異原に対してもXP細胞よりも有意に高感受性となった。
NBA付加体をLacZ遺伝子中のグアニンに１つもつシャトルベクターを作製して、TLSが細胞中で起こると大腸菌コロニーの色が付くシャトルベクター系を作製した。これを用いてΔPolηXP細胞とXP細胞における突然変異頻度を比較した結果、Polηが欠損すると突然変異頻度が有意に上昇した。
これらの結果から、NBA付加体の突然変異生成に寄与していることが示唆された。また、今後はNBA付加体の化学構造とPolηとのより詳細な関係、および他のTLSポリメラーゼの寄与を明らかにする必要がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウィルス感染拡大のため、非常事態宣言が発令されて、在宅勤務の推奨、大学院生の登校禁止などの措置が行われ、研究の進捗が遅れた。

Strategy for Future Research Activity

作製したTLSポリメラーゼ（ΔPolη、ΔPolκ/PIP、ΔPolι）欠損色素性乾皮症細胞（NER欠損）を用いて、３ーニトロベンズアントロン（NBA）、チミンダイマー、シスプラチン（CisPt）付加体をLacZ遺伝子中に１つもつシャトルベクターを作製して、誘発突然変異の種類と頻度を相互比較して、それぞれのDNA損傷由来突然変異に寄与するTLSポリメラーゼを明らかにする。

Causes of Carryover

新型コロナウィルス感染拡大による緊急事態宣言により、在宅勤務の増加、大学院生の登校禁止措置、学会の中止、出張の中止などにより、支出が減少した。次年度は残額を物品購入費、学会出張費に使用し、全額を使って研究目標を達成する予定である。