2018 Fiscal Year Research-status Report
A new method of rapid whole mount bone staining and its application for multiple staining
| Project/Area Number |
18K11659
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa Medical University |
|---|
Principal Investigator |
坂田 ひろみ 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (50294666)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八田 稔久 金沢医科大学, 医学部, 教授 (20238025)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 骨染色 / ラット / マウス / 多重染色 / ３Ｄ画像解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、我々が考案した小型魚類及びアフリカツメガエルの迅速骨染色法（RAP-B）をマウス・ラットに応用し、さらに骨染色と免疫染色の多重染色法を開発することを目的としている。
初年度である平成30年度は、まず、RAP-Bによる骨染色の手順をマウス・ラット胎児用に最適化するための検討を行った。安楽死させたICRマウスおよびWistarラット胎児を透明化固定液に浸漬した後、さらにエチレングリコール、界面活性剤、およびKOHを含む透明化促進液に浸漬した。その後、RAP-Bの手順で骨染色を行い、全身骨格標本を作製した。透明化促進液の使用により軟部組織の透明度がさらに高くなるため、標本サイズの大きいマウスおよびラット胎児では透明化促進液の使用が効果的であった。さらに、出生後ー成獣マウスで骨染色を行うため、新たな除毛法を考案し、RAP-Bの手順と組み合わせた骨染色法を開発した。除毛液にはメルカプト酢酸を含む溶液を使用した。また、骨染色後の軟部組織透明化にはBABBを用いた。さらに骨染色と免疫染色の多重染色法を確立するための予備検討として、RAP-Bで使用する透明化固定液と透明化促進液を用いたマウス胎児のWhole-mount免疫染色や、組織の厚切りスライスの免疫染色を試みた。胎生10又は11日のマウス胚で抗ニューロフィラメント抗体を用いたWhole-mount免疫染色を行ったところ、透明化固定液および透明化促進液の使用により従来法よりも良好な染色像が得られた。また、マウス成獣脳の厚切り切片の蛍光免疫染色においても透明化固定液および透明化促進液の使用により通常の染色よりも抗体の浸透性が向上し、陽性反応の３次元画像再構築に有用であることが示された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の研究目標は、（１）迅速骨染色法（RAP-B）のマウス・ラットへの応用、（２）RAP-Bを基にした骨染色-免疫染色の多重染色法の確立、および（３）本研究で確立した手法を毒性試験や発達異常のスクリーニング試験として実用化するための検討、である。このうち初年度は（１）を主な研究内容に設定していたが、予定通り、マウス・ラット胎児用にRAP-Bの手順を最適化することができた。さらに成獣マウスで骨染色を行うための除毛法の開発も行い、RAP-B法のマウス・ラットへの応用法をさらに充実させることができた。現在はRAP-Bで作製した骨染色標本から3D画像を構築する方法について検討を進めている。また、当初は次年度以降の研究内容として予定していた、透明化固定液と透明化促進液を用いた組織透明化手順の免疫染色への応用についても初年度に検討することができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は、当初の予定通り、主にRAP-Bによる骨染色と免疫染色を組み合わせた多重染色法の開発を行う。初年度に既にRAP-Bで用いる溶液（透明化固定液および透明化促進液）がマウス胎児のWhole-mount免疫染色や種々の臓器の厚切りスライスの免疫染色に有効であることを確認しているので、今後は骨染色と免疫染色の多重染色の具体的な手順を確立する予定である。また、本研究で確立したマウス・ラット用に最適化したRAP-Bの手順と骨染色―免疫染色の多重染色の手順を用い、胎生期バルプロ酸モデルマウス等の発達異常モデル動物を観察し、これらの手法を毒性試験や発達異常スクリーニング試験として実用化するための検証を行う予定である。さらに次年度以降は、本研究の研究成果を学会で発表し、また国際専門誌に投稿することを目標としている。
|
| Causes of Carryover |
初年度内に納品を希望していた試薬・器具等の納品が遅れることが予想されたため、一部の物品費を次年度使用とした。次年度使用とした予算については、当初予定していた試薬・器具を購入するため、次年度初頭に速やかに執行する。
|
