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2019 Fiscal Year Research-status Report

泡沫濃縮と次世代シーケンシングを利用した水環境中の病原細菌一斉検出法の開発

Research Project

Project/Area Number 18K11680
Research InstitutionUniversity of Miyazaki

Principal Investigator

鈴木 祥広  宮崎大学, 工学部, 教授 (90264366)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 真砂 佳史  国際連合大学サステイナビリティ高等研究所, サステイナビリティ高等研究, その他 (50507895)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords病原遺伝子 / マルチプレックスPCR / プライマー設計 / 一斉検出
Outline of Annual Research Achievements

PCR法は,食品安全性分析や環境調査に広く適用されている。また,複数の遺伝子を同時に増幅させ,細菌を検出するMultiplex PCR法も存在する。対象とする多数の病原遺伝子が増幅できれば,次世代シーケンサーによる各遺伝子のリード数からの定量的かつ一斉に解析が可能となる。そこで本研究では,大腸菌の7種類の病原遺伝子についてプライマーを設計した。そして,Multiplex PCR法によって病原性大腸菌を一斉検出する方法の開発を試みた。
PCR法による増幅確認を行った結果,eaeA遺伝子以外は増幅が確認できた。stx1,stx2,ipaH,STh,およびLTの5つの病原遺伝子については,設計した増幅サイズのバンドが確認された。大腸菌の特異遺伝子であるuidA遺伝子も増幅が確認された。また,ipaHにおいてuidA遺伝子が確認されなかった理由は,標準遺伝子が赤痢菌であったためであると考えられる。しかしながら,aggRとeaeAについては増幅が確認されなかった。aggRにいては,単独系のPCRで増幅が確認された。このことから,7種類の大腸菌の病原遺伝子のうち5種類を一斉に検出することが可能である。一方で,Multiplex PCR反応において増幅が確認できなかった病原遺伝子もあったため,高効率で増幅することができるプライマーの設計やPCR反応条件の最適化といった課題も確認された。Multiplex PCR法によって,7種類の大腸菌の病原遺伝子のうち5種類を一斉に検出することが可能となった。設計したプライマーの増幅サイズは300-400bpとしており,次世代シーケンサーによる一斉検出・定量が次年度最終の課題となる。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通りに,対象とする重要な病原遺伝子7種類のうちの5種について,Multiplex PCR法で一斉検出できる検出計を確立することができた。プライマーは増幅サイズは300~400 bpの範囲で設計しており,増副産物の定量への展開が可能となった。残る2つの遺伝子については,別の増増幅条件おいて,検出が確認されているため,2回のPCR検査で,全7種類の病原大腸菌の重要な遺伝子が検出できるようになった。したがって,研究の進捗状況は順調である。

Strategy for Future Research Activity

本研究課題のゴールは,全7種類の病原大腸菌の重要遺伝子の検出と定量である。2019年度において,2回のPCR検査で,全7種類の病原大腸菌の重要な遺伝子が検出できる遺伝子の増幅系が確立できている。そこで,最終年度の2020年度は,7種類の病原大腸菌の重要遺伝子の増副産物について,デジタルPCRによるコピー数と次世代シーケンサーのOTU数による定量化の比較・検討を行う。

Causes of Carryover

遺伝子解析の分析試薬類について,一括購入やバーゲン期間での発注を心がけたため,当初の計画よりも経費が削減できた。この削減分は,2020年度の遺伝子解析と次世代シーケンサーの試薬類に配当して効果的に経費を活用する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2020 2019

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (6 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Are bacteria potential sources of fish environmental DNA?2020

    • Author(s)
      Nukazawa Kei、Akahoshi Kentaro、Suzuki Yoshihiro
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 15 Pages: e0230174

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0230174

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Preliminary assessment of the impacts of sediment sluicing events on stream insects in the Mimi River, Japan.2020

    • Author(s)
      Nukazawa, K., Kajiwara, S., Saito, T., Suzuki, Y.
    • Journal Title

      Ecological Engineering

      Volume: 145 Pages: 105726

    • DOI

      10.1016/j.ecoleng.2020.105726

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Growth and antibiotic resistance acquisition of Escherichia coli in a river that receives treated sewage effluent.2019

    • Author(s)
      Suzuki, Y., Hashimoto, R., Xie, H., Nishimura, E., Nishiyama, M., Nukazawa, K., Ishii, S.
    • Journal Title

      Science of the Total Environment

      Volume: 690 Pages: 696-704

    • DOI

      10.1016/j.scitotenv.2019.07.050

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fast, sensitive, and reliable detection of waterborne pathogens by digital PCR after coagulation and foam concentration.2019

    • Author(s)
      Jikumaru, A., Ishii, S., Fukudome, T., Kawahara, Y., Iguchi, A., Masago, Y., Nukazawa, K., Suzuki, Y.
    • Journal Title

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2020.02.004

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 下水消化汚泥の遠心脱水プロセスにおける高分子凝集剤の最適薬注率の設定2019

    • Author(s)
      鈴木祥広, 遠藤圭吾, 大幸和佳奈, 糠澤桂, 古橋勇一, 仲元寺宣明
    • Journal Title

      水環境学会誌

      Volume: 42 Pages: 269-275

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Multiplex PCR 法による病原大腸菌 7 種の一斉検出系の確立.2020

    • Author(s)
      清水宏樹, 真砂佳史, 糠澤桂, 鈴木祥広
    • Organizer
      54回日本水環境学会年会
  • [Presentation] 凝集・泡沫濃縮法を利用した河川水からの病原大腸菌の検出・単離手法の開発2020

    • Author(s)
      片渕真人, 清水宏樹, 糠澤桂, 鈴木祥広
    • Organizer
      54回日本水環境学会年会
  • [Presentation] Development of Comprehensive Detection Method of Pathogenic Bacteria from River Water Combining Foam Concentration and Bacterial Flora Analysis.2019

    • Author(s)
      Shimizu, H., Jikumaru, A., Nukazawa, K., Masago, Y., Ogura, Y., Ishii, S., Suzuki, Y.
    • Organizer
      Water Environment Technology Conference 2019 (WET2019)
  • [Presentation] A Proposal of Source Tracking of Fecal Pollution in Recreational Waters by Applying Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE)2019

    • Author(s)
      uzuki, Y., Furukawa, T., Nukazawa, K.
    • Organizer
      AOGS2019 in Singapore
    • Invited
  • [Presentation] Resistant Escherichia Coli Isolated from Livestock, Wild Animals and Wastewater in a Stock Farm.2019

    • Author(s)
      Hiroki, H., Kobayashi, I., Sakamoto, S.H., Uemura, R., Nukazawa, K., Suzuki, Y.
    • Organizer
      Water Environment Technology Conference 2019 (WET2019)
  • [Presentation] 自然河川における大腸菌と腸球菌の薬剤耐性率の比較および汚染源の推定2019

    • Author(s)
      鈴木祥広, 西村恵美, 糠澤桂
    • Organizer
      第22回日本水環境学会シンポジウム

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Published: 2021-01-27  

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