2018 Fiscal Year Research-status Report

産業廃棄物活用を目指した有用有機酸類の合成：集積型バイオプロセスの新基盤開発

Research Project

Project/Area Number	18K11704
Research Institution	Iwate University
Principal Investigator	山田美和岩手大学, 農学部, 准教授 (90586398)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	エチレングリコール / グリコール酸 / グリオキシル酸 / アルコール酸化酵素 / ＴＡＴ経路
Outline of Annual Research Achievements	産業廃棄物成分を原料とし、微生物細胞を用いた有用有機酸の集積型バイオプロセス構築を目指して、本年度は目的の反応系構築に必要な3種類の酵素を組換え大腸菌における共発現系の構築を行った。３種の酵素遺伝子を組換え大腸菌で発現し、各酵素の活性測定を行った結果、粗酵素において活性が確認されたため、各酵素が組換え大腸菌細胞内で発現していることが確認できた。また、目的の反応系において３段階目の反応を触媒するアルコール酸化酵素が律速と考えられたことから、本酵素の活性向上変異体の作成に着手した。本酵素遺伝子全域にランダム変異を導入し、各変異体遺伝子を導入した組換え大腸菌の粗酵素液を用いて活性測定を行い、高活性変異体の探索を行った。結果、野生型酵素と比較して、活性が1.2～1.3倍向上した変異酵素を取得することに成功した。各変異体のアミノ酸置換部位を特定した結果、本酵素の活性向上に有効なアミノ酸領域は、フラビン結合モチーフ領域とグルコースメタノールコリン酸化還元酵素ファミリーの保存領域周辺であることが明らかとなった。本研究では最終的にtwin-arginine translocation(TAT)シグナルを用いて、3種の酵素を大腸菌のペリプラズムに局在させ、酵素反応の効率化を目指している。３段階目の反応を触媒するアルコール酸化酵素は、オリジナルのTATシグナルを有しており、組換え大腸菌細胞内においてもすでにペリプラズムに局在していることが予想された。本研究では、本酵素が組換え大腸菌細胞内で発現した際もペリプラズムに局在していること、および第１、２段階目の反応を触媒する酵素は、細胞質内に局在していることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、まず目的の反応系構築に必要な3種類の酵素を組換え大腸菌における共発現系の構築を行った。３種の酵素遺伝子を組換え大腸菌で共発現し、各酵素が組換え大腸菌細胞内で発現していることを確認した。また、目的の反応系において、律速と予想される３段階目の反応を触媒するアルコール酸化酵素の活性向上変異体の作成においては、野生型酵素と比較して、活性が1.2～1.3倍向上した変異酵素を取得することに成功した。さらに、各変異体のアミノ酸置換部位を特定し、本酵素の活性向上に有効なアミノ酸領域を明らかとした。また、本研究で目指す３種酵素の大腸菌ペリプラズムへの局在化については、第１、第２段階目の反応を触媒する酵素が細胞質内に局在していることを確認し、３段階目の反応を触媒するアルコール酸化酵素は、オリジナルのTATシグナルを用いて、組換え大腸菌細胞内においてすでにペリプラズムに局在していることを確認できた。よって、上述したように、初年度で予定していた研究内容をほぼ達成することができたため、（２）と自己評価した。
Strategy for Future Research Activity	次年度は、律速反応である３段階目のアルコール酸化酵素の活性向上変異体作成に関する研究を引き続き行う。上述したように、現在までに本酵素の活性向上に重要なアミノ酸置換部位が特定されてきたため、活性向上を示すアミノ酸置換を網羅的に掛け合わせたり、特定のアミノ酸置換領域において総アミノ酸置換を導入してさらなる高活性変異体の創出をめざす。また、高活性体創出へ向けて他のアミノ酸置換部位の探索も引き続き継続する。さらに、第１、２段階目の反応を触媒する酵素が細胞質内に局在していることを現在までに確認できたため、今後は大腸菌由来のTATシグナルを第１、２段階目の反応を触媒する酵素遺伝子に融合し、組換え大腸菌内でペリプラズムに局在させることができるか検討する。目的の酵素反応に必要なすべての酵素をペリプラズムに局在させることができた際には、３種の酵素を共発現させた組換え大腸菌株を用いて、産業廃棄物由来の成分と休止菌体反応を試みる。そして、目的の有用有機酸の合成量が高い反応条件を検討する予定である。
Causes of Carryover	高活性変異体作成実験において、予想していたよりも得られた高活性変異体の数が少なかったため、DNAシークエンス解析や遺伝子操作に関わる試薬の購入費に余剰が生じた。次年度も高活性変異体の作成実験を継続するため、新たな変異体のアミノ酸変異点を特定するためのDNAシークエンス解析および遺伝子操作実験に関する試薬やプラスチック製品等消耗品に対して使用する。