バイオ水素ガス生産の基盤技術となる嫌気性細菌の遺伝子改変技術確立とその応用

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K11708
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 木村 哲哉 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (00281080)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 水素ガス / セルロース / 乳酸

Outline of Annual Research Achievements

水素ガスを高生産するClostridium paraputrificumから遺伝子改変技術により、水素ガスを効率的に生産する菌株の作出を目的として基本的な代謝経路の解明を行った。今までの研究成果より、乳酸を生産する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（LDH）を破壊することで水素ガス生産が増えたことから、この経路と水素ガス生産との関連を詳しく調べた。まず、さまざまな炭素源で培養を行ったところ、LDH破壊株は全ての条件で水素ガスの生産が増加した。この結果は、LDH遺伝子の破壊によって乳酸生産経路が遮断され、水素ガス生産経路であるピルビン酸からアセチルCoAへの代謝の流れが強化された結果であると推測された。また、野生株では乳酸が生育を抑制し水素ガス生産が抑制されているのではないかと考えたが、乳酸添加培地では非添加に比べて約1.5倍多く水素を生産し、乳酸の生産も低下した。さらに、LDH破壊株においても乳酸添加で水素ガス生産が増加したことから、乳酸が影響を与える他の代謝経路の存在も示唆された。本菌の水素ガス生産経路と並列で存在することが予測されるピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素（PFL）の機能解明のためPFL遺伝子の破壊を試みた。LDH遺伝子破壊でも利用したClostron法でいくつかの配列をデザインしたプラスミドの作成を行い、遺伝子破壊を試みたが形質転換体が得られなかったため、PFL遺伝子が生育に必須である可能性が示唆された。植物細胞壁（セルロース）分解能力を持つR. josuiはC. paraputrificumと共培養することでセルロースから直接水素ガスを生産することが可能である。R. josuiの遺伝子工学はセルロース分解を効率的に行うためには必要な技術であることから、本菌の電気穿孔法を用いた形質転換方法を開発することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

C. paraputrificumにおいて、水素ガス生産に非常に重要な意味をもつ乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の代謝上の機能について詳細に解明することができた。他の遺伝子についてもほぼ遺伝子破壊が可能な状況となったが、一部の遺伝子については破壊株の取得が困難であることがわかった。R. josuiの形質転換方法を確立することができたことから、今後の遺伝子工学的な解析に道が開けた。

Strategy for Future Research Activity

C. paraputrificumにおいて、基本的代謝経路上で働く遺伝子を順次破壊することで、どの経路が水素ガス生産にとって重要な役割を果たしているかを明らかにする。一方、遺伝子破壊ができない、すなわち生育に必須の遺伝子がある可能性が示唆されたことから、これらの遺伝子の機能を解明するために、遺伝子の機能を条件的に弱めた株の育種も行う必要があるが、これについてはまだ具体的な対策が見つかっていない。
R. josuiの形質転換方法は開発できたが、遺伝子導入効率は低く、遺伝子破壊が可能な状況に持っていく必要があるため、引き続き条件検討を行っていく。

Causes of Carryover

作成予定の遺伝子破壊株のいくつかについて、何度か試みたものの予想に反して破壊株の作出ができなかったため、破壊株の培養と解析にかかる経費について未使用となった。遺伝子破壊条件を変更して、再度実験を行う予定である。