2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K12075
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| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小幡 亜希子 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40402656)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 生体材料 / ガラス / 無機イオン / 細胞 / 免疫 / 骨形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
無機イオンによる細胞への活性化効果を最大限に活かすべく、ガラスを活用した材料組成設計と申請者らの独自の技術による形状設計を組合せることで、新しい生体材料を開発することが本研究課題の目標である。
骨や歯などの硬組織を再建するための生体材料開発において、多くは骨再建に特化した細胞（骨芽細胞や破骨細胞など）や血管形成を担う細胞との関連について主に調査されてきた。一方で近年の研究により、免疫系細胞を伴う炎症過程はその後の新生骨形成に寄与する間葉系幹細胞や骨芽細胞の活性にまで影響を及ぼすことがわかっている。しかし、細胞単位での免疫系および骨形成を担う細胞間の相互作用について既に多くのことが明らかとなっている一方、硬組織再建用の生体材料存在下においては未知な部分が多い。特に、材料由来因子が上述した相互作用に対しどのように関与するか、そして骨の形成機能や形成された骨の質などに対しどのような影響を及ぼすか不明である。
以上のことをふまえ、身体内にて起こる初期炎症反応から骨形成までの流れを見据え、これまで着目されていなかった『免疫系細胞（マクロファージ）→間葉系幹細胞→骨芽細胞・血管内皮細胞』経路で起こる細胞間クロストークに対する、Cu, Zn, Co, Ca, Si等の無機イオンの影響を明らかにする。複数種のイオンが同時に供給された系も検討することで、目指すガラス組成を設計し、独自の技術で3D綿状繊維構造のゾルゲルガラスを作製する。細胞応答性を操作するだけでなく、実用性を考慮した柔軟性と操作性を兼ね揃えた生体用ガラス綿材料の開発を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、マウス由来マクロファージ（RAW264.7）単体の代謝活性に対する各種イオンの影響について主に検討してきた。
各種イオンによる影響を検討するにあたり、イオンの種類及び濃度条件を変化させてイオン含有培養培地を作製し、これを用いてマクロファージを最長３日間培養し、細胞活性を経時的に評価した。各イオン濃度は10~500 ppm範囲とし、当初予定していたCu, Zn, Co, Ca, Siに加え、Mg, Srの計7種のイオンを対象に検討した。細胞の代謝活性はAlamar blue色素の酸化還元反応を利用した蛍光発色測定およびDNA量測定から求めた。
その結果、DNA量の推移に着目した場合、コントロールサンプルとなる通常培地の結果と比較し、Si, Ca, Mg系では同程度の値を、Zn, Co系では有意に低い値を、Sr, Cu系では有意に高い値を示すことがそれぞれわかった。つまり、この7種のイオンを比較した時、イオンの種類によってマクロファージの応答性は変化し、促進及び抑制の作用を示すことがわかった。この時、Si, Ca, Mg系を除くイオン種の系において、上記のような傾向は濃度依存性を持つことも見出した。
以上のことから、免疫細胞の一つであるマクロファージは、生体用セラミックス材料から溶出するイオンに対し、その種類及び濃度に依存した特異な応答を示すことがわかった。このような応答性の変化は、マクロファージのサイトカイン産生機能に対しても影響を与えていることが予想される。つまり、材料から溶出するイオンが、免疫反応を介した骨形成機能の発現に対して作用する可能性を示す結果であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
材料から溶出するイオンが、免疫反応を介した骨形成機能の発現に及ぼす影響を調査すべく、イオンの影響を受けたマクロファージについて、そのサイトカイン等産生物を調査するとともに、産生物による間葉系幹細胞への影響について調査する。
具体的には、各イオン存在下で培養したマクロファージの培養上清を用いて、間葉系幹細胞（KUSA-A1）を培養したときの骨形成性細胞への分化程度について検討する。上清を使用して培養することで、マクロファージのサイトカイン産生に対しイオン種や量による影響を検討するとともに、産生物による間葉系幹細胞への効果について評価する。
まずは、培養上清の添加条件などを最適化させ、本評価実験の基本となる条件を見出す。その後、各イオン条件で得られた培養上清を用いて間葉系幹細胞を培養する。分化過程の評価には、間葉系幹細胞のアルカリフォスファターゼ活性値やコラーゲン産生量などの測定を用いる。
間葉系幹細胞への影響について検討をしたのち、血管内皮細胞への影響またはマクロファージとそれら細胞の共培養系についても検討を行う。これらの検討結果をふまえ、次に合成すべきガラス材料組成を決定する。
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| Causes of Carryover |
上述した通り（「現在までの進捗状況」参照）、本研究課題にて対象とするイオンの種類を当初の予定よりも増やした。これは、過去の報告例を参照し、本研究課題にて検討すべきイオン種として重要と考えたためである。その結果、マクロファージ単体に対する実験・評価に想定以上の時間と労力を費やすこととなった。しかしその成果として、イオンの種類の違いによるマクロファージの細胞応答性の変化について、多くの知見を得ることに成功した。
以上のように、2018年度はマクロファージ単体に対する評価に注力し、一方で間葉系幹細胞や血管内皮細胞など他細胞を用いた実験を次年度に繰り越すことにした。その結果、他細胞の実験に用いる予定であった消耗品（培養培地、測定キット等）は次年度にて使用することに変更し、これに付随して経費の使用計画も変更することとなった。
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