2018 Fiscal Year Research-status Report
ヒアルロン酸を用いた外来抗原ペプチドデコレーションによるがん細胞の抗原性の改変
| Project/Area Number |
18K12082
|
|---|
| Research Institution | The University of Kitakyushu |
|---|
Principal Investigator |
望月 慎一 北九州市立大学, 国際環境工学部, 准教授 (10520702)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | がんワクチン / 薬物送達システム / 免疫療法 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
がんワクチンは生体が自ら持つ免疫機能を活性化してがん細胞を攻撃する治療法であるが、多くのがん細胞はそうした免疫細胞からの攻撃を回避するためにがん抗原の提示量を減らしている。また、仮に抗原を提示していても元は自身のタンパク質由来であるため、抗原性も決して高いわけではなく強力な免疫を誘導するための目印としては非常に弱い。そこで本研究では、がん細胞上の目印となる抗原分子をより抗原性の高いものへ薬物送達システムを利用して置換させることである。
がん細胞に抗原性の高いタンパク質であるオボアルブミン（OVA）を添加し、強制的に表面上に抗原を提示させたがん細胞を作製した。抗原提示がん細胞に対しOVA免疫したマウスから採取した脾臓細胞（OVA特異的障害性T細胞含む）を添加すると、強い炎症反応が観察された。このことは本研究の根本にある非自己由来の抗原を提示したがん細胞に対し、免疫細胞が強力に応答することを示している。
ヒアルロン酸（HA）のカルボキシル基を活性化エステルに変換後、OVAのリシン残基との間での縮合反応を試みたところ、HAよりも大きな分子が出来ているのをゲル浸透クロマトグラフィーより確認することが出来た。これよりHA－OVAコンジュゲート体が出来ていることがわかった。しかし、OVAの反応効率は約60%であるため未反応のOVAも確認される。今後はHAとOVAの仕込み比あるいは縮合剤濃度を変えることで反応効率の向上を図る。
来年度にはHA－OVAコンジュゲート体の作製において最適化を行い、がん細胞への取り込みの評価を行う予定である。また、in vitroの系でHA-OVA処理がん細胞とOVA特異的免疫細胞を混合させ、OVA処理がん細胞と比較し炎症反応のどう変化するか観察する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Balb/cマウスにOVAとアジュバントとしてCpG-DNAを皮内に２回免疫を行い、２回目の免疫から１週間後に脾細胞を採取した。一方、マウス大腸がん細胞（CT26）にOVAを添加し、24時間後に先の脾細胞と混合させ、さらに24時間培養後に上清中のインターフェロンガンマ（IFN-g）量を酵素結合免疫測定法（ELISA）で評価した。OVA未処理がん細胞に対してOVA処理がん細胞からは有意なIFN-gの産生が観察された。この結果よりがん細胞がOVAを取り込み抗原としてOVAを細胞表面上に提示し、OVA特異的T細胞がそれに応答していることを示している。これより本研究の基本的概念となる外来抗原を人為的に提示させることが出来れば強い免疫応答を誘導可能であることが示された。
一方、HA-OVAコンジュゲート体作製においてはHAよりも分子量の大きなコンジュゲート体を得ることが出来た。面白いことにコンジュゲート体はHAよりも分子量は大きいが慣性半径は小さくなっていることが分かった。これは、多数の反応点を持つHAとOVAが複数個結合し、さらに分子内架橋を起こし、折りたたまれた構造を取っているのだと考えられる。こうした複数の反応点を有するためか一部、凝集体の生成も目立ち収率が落ちてしまっている。HAとOVAの混合比や混合濃度、縮合剤の濃度等、反応をコントロールすることで大きさの異なるコンジュゲート体が得られるよう、また、架橋の度合いを抑えて凝集を防ぎ収率をあげられるよう努める。
|
| Strategy for Future Research Activity |
HA－OVAコンジュゲート体では様々な大きさのコンジュゲート体を作製し、それぞれに対しがん細胞への取り込まれやすさを評価する。得られたコンジュゲート体に蛍光修飾しがん細胞に添加、各時間に蛍光顕微鏡観察あるいはフローサイトメトリーにより、取り込み量とコンジュゲート体の形状・大きさとの関係性を明らかにする。また、今回のコンジュゲート体はがん細胞の表面上に過剰に発現しているCD44がHAを認識しOVAを取り込むと考えている。得られたコンジュゲート体がCD44を介して取り込まれるかどうか、CD44ノックアウト細胞を作製し、取り込み量の変化からそのメカニズムを明らかにする。
CT26細胞をHA－OVAコンジュゲート体で処理し、OVA特異的T細胞と混合し産生されるIFN-g量を定量する。本年度実施したOVAのみの処理と比較し、コンジュゲート体処理では、がん細胞のOVAの取り込み量が飛躍的に上がると期待される。同時に細胞表面上に提示されるOVA断片量も増加し、T細胞による認識も上がりより強い免疫応答の誘導（IFN-ｇの産生量の向上）が期待される。
CT26を皮下に移植したマウスを用意し、HA－OVAコンジュゲート体を直接投与し、in vivoで効率よくOVAが腫瘍組織に取り込まれるか検討する。
|
| Causes of Carryover |
当初予想していたよりも少ないタンパク量、ヒアルロン酸量で、コンジュゲート体作製の基礎実験を行うことが出来たため、本年度の使用額をその分抑えることが出来た。次年度は、この分と併せて得られたコンジュゲート体の細胞実験、動物実験に使用する予定である。また、細胞実験までの結果が得られれば薬学系の学会での発表の機会も設けたいと考えている（そのための旅費に使用予定）。
|
Research Products
(5 results)
